抗原致敏IL-12基因修饰的树突状细胞诱导抗肾癌免疫的体外研究.DOCVIP

临床医学论文-抗原致敏IL-12基因修饰的树突状细胞诱导抗肾癌免疫的体外研究 ???????????????????? 作者：罗道升， 戴宇平， 张珑涓， 赵继宗， 郑伏甫 罗彬 【摘要】? 【目的】 探讨肾癌细胞抗原致敏白介素-12（IL-12）基因修饰的树突状细胞（DC）体外诱导、激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫杀伤肾癌细胞的效能及相关免疫机制。【方法】 采用重组逆转录病毒介导IL-12基因修饰人外周血单个核细胞(PBMC)来源的DC；超声细胞破碎法提取肾癌细胞粗提抗原（Ag）致敏经IL-12转染的DC；ELISA法检测各组DCs和各组CTLs上清中IL-12、IFN-γ因子的分泌水平；流式细胞仪(FACS)分析各组DCs表面CD83 、CD86、HLA-DR的表达； MTT法检测DC刺激同源T淋巴细胞增殖的能力及CTL免疫杀伤肾癌细胞的效能；统计学分析比较各组间的差异。【结果】 经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC高表达CD83 和CD86分子分别为(65.9%±3.1%, 92.8%±3.4%），分泌高水平IL-12 (279.6 ±1.7)pg/mL及IFN-γ (892 ±31)pg/mL，刺激同源T淋巴细胞增殖明显，诱导激活的CTL上清中IFN-γ水平(1146±31)pg/mL显著高于对照组；CTL对肾癌细胞有强大的杀伤作用，显著高于各对照组。【结论】 经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC能有效地诱导CTL特异性抗肿瘤免疫应答。其机制可能与IL-12基因修饰和抗原致敏活化了DC抗原提呈第二信号，促进了DC高分泌IL-12因子，激活了T淋巴细胞致使CTL分泌IFN-γ的能力增强密切相关。 【关键词】? 肾细胞癌； 肿瘤抗原； 白细胞介素-12； 树突状细胞； 肿瘤疫苗 树突状细胞(dendritic cell, DC)是体内功能最强的抗原提呈细胞，它能直接诱导、增殖、活化T淋巴细胞，产生特异性免疫应答[1]，在启动抗肿瘤免疫反应中起关键作用[2]。研究表明癌组织中DC的数量是肿瘤预后的重要参数之一[3]，研究也发现荷瘤宿主体内存在一定数量的DC，但DC的数量、形态、表型异常，免疫能力差[4]。因此，构建一种以DC为基础的瘤苗，对DC进行一定的修饰，籍以增强DC的免疫功能将能增强肿瘤患者的免疫功能。本研究采用786-0肾癌细胞株粗提抗原致敏和IL-12基因转染DC，制备成DC瘤苗，观察其体外诱导自体T淋巴细胞产生特异性抗肾癌免疫的效能，并对结果进行分析。 ??? 1?? 材料与方法 ??? 1.1?? 材料 ??? 1.1.1?? 主要试剂?? RPMI-1640购自Gibco公司；特优级胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司；重组人粒细胞-巨噬细胞集落群体刺激因子(rhGM-CSF), 重组人白细胞介素-4(rhIL-4)，重组人白细胞介素-2(rhIL-2)购自Peprotech公司；人IL-12ｐ70和IFN-γ ELISA检测试剂盒购自晶美公司；FITC标记的鼠抗人HLA-DR、CD83 、CD86抗体均为PharMingen及caltag公司产品；淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque）为上海试剂二厂；流式细胞仪为美国BECKMAN-COULTER(贝克曼-库尔特)公司产品；酶标仪为荷兰MULTISKAN MK3公司产品；超声细胞破碎仪为美国SONICSMATEIALS公司产品。 ??? 1.1.2?? 病毒载体和细胞系?? PA317-IL-12重组逆转录病毒由北京大学深圳医院李宝金博士后惠赠，其病毒滴度为1.1×105～1.4×105 CFU/mL；786-0肾癌细胞株购自上海中国科学院细胞库。 ??? 1.2?? 实验分组设计 ??? 1.2.1?? DC分组?? ①实验组：抗原致敏IL-12基因修饰DC 组(DCIL-12+Ag)；②对照组：抗原致敏DC组 (DCAg)；③对照组：IL-12基因修饰DC组 (DCIL-12)；④DC对照组(DCnaive)。各组样本数均为6。 ??? 1.2.2?? CTL分组?? ①实验组：抗原致敏IL-12基因修饰DC刺激组 (CTLDC-IL-12+Ag)； ②对照组： 抗原致敏DC刺激组 (CTLDC+Ag)；③对照组： IL-12基因修饰DC刺激组 (CTLDC-IL-12)；④对照组： DC刺激组 (CTLDC-naive)； ⑤T细胞对照组（Tnaive）。各组样本数均为6。 ??? 1.3?? 方法 ??? 1.3.1?? 树突状细胞的体外诱导和培养?? 外周血来自临床血库新鲜全血300 mL，每次取50 mL，用淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞(PBMC)，用无钙镁PBS液（pH 7.2）洗2～3遍，调整细胞浓度为106 ce