肺炎链球菌荚膜缺陷菌株的构建及功能研究.DOCVIP

临床医学论文-肺炎链球菌荚膜缺陷菌株的构建及功能研究 ??????????????? 作者：孟江萍，尹一兵，袁军，张雪梅，蓝锴，陈淑惠，王虹，涂植光 【Abstract】AIM：To construct galU-deletion mutant of streptococcus pneumoniae and get the capsule deficient strain, which can be used in pneumococcal functional genome research. METHODS:?LFHPCR was introduced to generate a gene disruption construct consisting of Emr cassette with long flanking homology regions to the target gene. The streptococcus pneumoniae was then transformed directly with this PCR product. The galUdeletion mutant was obtained on the TSA agar containing erythromycin and identified by PCR. The deficient strain (5?06 CFU) was applied to infect BALB/c mice to determine the virulence. RESULTS:?GalU gene was replaced completely by erm cassette. The mutant had low virulence to BALB/c mice. CONCLUSION:?The galUdeletion mutant can be used to screen in vivopromoter in streptococcus pneumoniae because it is incapable of synthesizing capsular polysaccharide and hence loses virulence. The target gene can be replaced completely by LFHPCR product, so this method is simple, rapid and effective for functional genome research of streptococcus pneumoniae. 　　【Keywords】? streptococcus pneumoniae；polysaccharides ,bacterial；mutation；polymerase chain reaction 　　【摘要】目的：? galU基因是肺炎链球菌荚膜合成的关键基因，构建该基因的缺失突变体，获得肺炎链球菌荚膜缺陷菌株，研究其生物学功能，并为肺炎链球菌功能基因组研究提供实验菌株和技术平台. 方法： 采用长臂同源多聚酶链式反应（LFHPCR）方法制备中间为红霉素耐药基因（erm），两侧为galU基因上、下游同源序列的连接片段，并将此片段转化入肺炎链球菌，在含红霉素的血平板上筛选出缺陷菌株.用PCR鉴定缺陷菌株，小鼠实验研究其毒力.结果： PCR结果显示galU基因完全被erm基因所替代，小鼠毒力实验表明缺陷菌株毒力显著下降.结论： galU缺失突变体在小鼠体内不能形成荚膜导致其难以在小鼠体内存活，可作为筛选肺炎链球菌体内诱导启动子的宿主菌.用LFHPCR作基因突变，可完全替代靶基因，简便、快速，是肺炎链球菌功能基因组研究的一种有效的方法. 　　【关键词】 链球菌，肺炎；多糖类，细菌；突变；聚合酶链反应 　　0引言 　　肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae,S.pn）是一种常见的条件致病菌，可引起肺炎、中耳炎、菌血症、脑膜炎等严重疾病.荚膜多糖的合成是一个多基因参与的过程，S.pn染色体上有关荚膜合成的基因位于dexB 和 aliA 基因的之间，形成操纵子结构（cap operon），参与型特异性荚膜的合成（据此可将S.pn分为90多个血清型），但是在荚膜操纵子外还存在一些基因对荚膜的合成非常重要［1］.有研究表明在所有S.pn中都存在galU基因，其编码的UDP葡萄糖焦磷酸化酶（UDPG：PP）是荚膜多糖生物合成过程中的关键酶［2］.研究证实肺炎链球菌galU基因不是细菌生存所必需的基因［3］，为可以成功构建其突变株提供了理论依据.基因缺失技术是