华支睾吸虫成虫钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白的筛选及其生物学活性的研究.pdfVIP

华支辜吸虫成虫钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白的筛选及其生物学活性的研究 关键词 钙调神经磷酸酶CaN 钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白CBLP 药物靶标 生物信息学 华支辜吸虫 Key words: Calcineurin(CaN), calcineurin B-like protein(CBLP), pharmaceuticaltarget,bio-informatics,Clonorchissinensis 华支辜吸虫成虫钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白的筛选及其生物学活性的研究 中文摘要 华支辜吸虫病是由华支皋吸虫(Clonorchissinensis)寄生于人体肝胆管内引 起。华支翠吸虫感染可引发慢性胆囊炎、胆结石，甚至肝硬化、肝癌，目前尚 没有有效的早诊断、早治疗综合防治措施。而对华支皋吸虫基因组的研究刚刚 起步，对功能蛋白的研究很少，限制了诊断抗原和防治药物/疫苗的研制，因此 筛选华支架吸虫功能基因，寻找药物靶标具有重要意义。 钙调神经磷酸酶 (Calcineurin,CaN)是一种广泛分布的、受Caz/钙调素 调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，由一个催化亚基 (CaNA)和一个调节亚基 (CaN B)组成的异源二聚体。CaNB是维持CaNA高效特异的催化活性必需的，属 于钙结合蛋白家族，是Caz+下游的一种效应分子，可参与多种细胞功能的调节， CaN是维持新生隐球菌毒性必须的、在草履虫的生命活动中具有重要作用。CaN 的特殊抑制剂环抱菌素A (CsA)和FK506及FK506模拟物，CsA和FK506 是免疫抑制药物，它们分别与环抱素A受体 (cyclophilin，CYP)和FK506 结合蛋白结合形成的复合物可以有效抑制CaN，进而达到杀灭病原体的目的。 因此CaN具有作药物靶标的潜能。而对华支辜吸虫CaN的研究未见报道，因 此筛选CBLP作为药物靶标进行研究，以有效防治华支皋吸虫病。 本文利用生物信息学方法，对华支辜吸虫cDNA文库的EST序列进行同源 性比对、序列拼接及基因完整性判断后，筛选出钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白 (calcineurinB-likeprotein，CBLP)基因。主要工作有以下内容: 1CBLP的筛选与生物信息学分析 对华支翠吸虫成虫cDNA文库的EST序列 中有 3’端测序结果的基因序列进行拼接，经同源性分析，CsCBLP与褐家鼠 CaN同一性53%，与尾刺耐格里原虫CaNB同一性40%，与新小杆线虫属结合 蛋白的同一性51%，选择CsCBLP，进一步研究其生物学功能。 应用NCBI上的RPSBLAST对 CsCBLP的保守域进行搜索比对，利用 PredictProtein分析、预测CsCBLP的功能域及二级结构，结果显示CsCBLP是 钙调神经磷酸酶B亚基的的类似物，属于钙结合蛋白家族。 2克隆及鉴定 将CsCBLP基因克隆入高效表达载体pGEX-4T1，经酶切及测 华支辜吸虫成虫钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白的筛选及其生物学活性的研究 序鉴定，重组pGEX-CsCBLP质粒正确。 3重组蛋白表达、纯化 I程菌BL21(DE3)/pGEX-CsCBLP经IPTG诱导3- 4小时，对表达产物进行SDS分析。诱导菌表达一条分子量为48kD左 右的蛋白带 (其中GST分子量26kD,CsCBLP分子量为22kD)，其分子量与 预测的蛋白质分子量大小一致，而未经 IPTG诱导的菌体蛋白在此处呈阴性。 经薄层扫描分析，GSTCsCBLP融合蛋白占菌体总蛋白的21%。采用GST亲合 层析柱纯化GSTCsCBLP，应用GST的单克隆抗体进行Westernblot，结果显 示在预测的分子量大小处出现杂交带。表明重组pGEX-CsCBLP质粒可以正确 表达。 4蛋白酶切重组CsCBLP 用thrombin蛋白酶对经GST亲合层析柱纯化的融合 蛋白GST-CsCBLP酶切，PBS洗脱。用此纯化的蛋白进行生物学活性实验。 5rCsCBLP生物学活性分析 1)rCsCBLP的免疫反应性 应用华支辜吸虫患者血清进行Westernblot，未在预测的分子量大小处出现 阳性带，这表明华支辜吸虫的CsCBLP是胞内蛋白，是非分泌蛋白，机体未对 其产生抗体:也可能是重组蛋白丧失天然蛋白的结构，天然蛋白诱导机体产生 的抗体不能识别重组蛋白。可以初步判断CsCBLP不是循环抗原。 2)rCsCBLP的钙结合能力 偶氮肿III法测定及SDS电泳结