前体蛋白加工酶类ADAM17及PC7与肿瘤生长相关性的初步探讨.docVIP

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 中文摘要 ADAMs（Disintegrin metalloproteases, ADAM）是近年来发现的一类与细胞膜结 合的基质金属蛋白酶，迄今文献报道已有 4 0 多种 ADAM s，其大部分成员都含有金 属蛋白酶结构域，可加工 TNF-a，所有的 EGFR 配体（EGF，HB-EGF 等），TNF 受 体 I 和 II、ErbB2、ErbB4 的受体，APP 等大量蛋白，在细胞外基质的降解、细胞-细 胞的黏连、细胞-基质的黏连、细胞融合及信号转导等细胞活动中具有重要作用。已 有的初步研究，ADAM10、17 是以跨膜前体蛋白的形式定位于质膜和 Glogi 体的反面 （trans face）膜表面，它们的激活也需要上游金属转换酶的加工。有研究显示 A D A M l 0、17 在一些肿瘤和组织细胞中高表达，ADAM17 在神经胶质瘤细胞中有促细胞增 殖作用，因此有必要研究在其它肿瘤细胞中，它是否也能发挥促细胞增殖的作用。 在 2008 年自然杂志的一篇综述文章专门阐述了 ADAM 家族成员可能在肿瘤发生 及转移过程中所发挥的“信号通路剪刀”的作用。而 ADAM l 0,17 便是其主要成员，它 们可通过水解加工活化表皮生长因子，转化生长因子等一些膜蛋白的胞外区，进而可 能有促进肿瘤细胞增殖的作用。 真核细胞中许多具有生物活性的多肽和蛋白前体在分泌过程中需被加工激活成 为成熟型的蛋白才能发挥作用。上游前体蛋白转化酶 PCs（proprotein convertase) 是 胞浆内存在的一类具有加工功能的酶，其成员包括 Furin，PC1/3, PC2, PC4, PC7/8/LPC, PACE, PC5/6 等。其靶分子包括众多生长因子的受体如 TGF-βR，体肝细胞生长因子 HB-EGFR，PDGFR-A，PDGFR-B，胰岛素样生长因子受体等；降解 ECM 的酶 MMP， MT-MMPs 等及解整合素金属蛋白酶 ADAMs，TADAMS 等。 另外有研究表明 Furin，PC7 对 ADAM10 有加工作用，PC7 能识别 ADAM10 的 RKKR 位点，释放 N-端前肽序列，促使其前体成熟，故 PC7 可看作 ADAM10 的主要 激活酶。因此，我们推测 Furin，PC7 可能通过对 VEGF-C，IGF-I 等蛋白加工的直接 途径或通过对 ADAM10，17 加工的间接途径在肿瘤发生发展过程中发挥作用。目前 已在乳腺癌，卵巢癌（9）等肿瘤组织中检测到 ADAM10，17, PC7 的高表达，但它在各 种肿瘤发生及转移过程中是否发挥作用及如何发挥作用，都有待进一步研究。 因此我们拟探讨ADAM17及PC7与肿瘤细胞生长之间的关系，通过构建大鼠 PC7 2 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 的真核表达载体及利用已构建的ADAM17真核表达载体，瞬时转染对数生长期的肿瘤 细胞；采用Western blotting检测ADAM17及 PC7蛋白水平在肿瘤细胞中的表达情况； MTT法和FACS检测观察转染后对细胞生长的影响；RT－PCR检测PC7和ADAM10在 基因水平上的表达。 酶切和基因测序结果证实含PC7目的基因的质粒构建成功；RT－PCR结果表PC7 在mRNA水平上有表达；Western blotting显示转染细胞后ADAM17, PC7得到表达；但 PC7在mRNA水平对ADAM10的表达影响不大；MTT和FACS检测结果说ADAM17对 Hela细胞生长有促进作用, PC7可能对MCF-7和Hela细胞生长的没有影响。  关键词:  PC7；ADAM17；ADAM10 ; 细胞增殖 3 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Limited study on the relevance of proprotease ADAM17 and its upstream convertases PC7 with the growth of tumor cells ABSTRACT Disintegrin metalloproteases (ADAMs) are found in recent years which belong to a class of matrix metalloproteinase binding to the cell membrane. So far we know that ADAM s family contains more than 40 members, the majority of them have metalloproteinase domain which can process TNF-