CILP在骨关节炎和类风湿性关节炎中自身免疫作用的研究.pdf

诱发了多发性关节炎的表现，研究了这个关节炎动物模型的病理学和免疫 学的特点。我们的研究结果强烈的提示在关节炎的致病机制中，CILP可能 具有活跃的诱发自身免疫反应的作用。 份料方法 一、CILP基因重组蛋白的亚克隆构建及诱生表达 1.人CILP基因的亚克隆:基于文献报导的CILP的基因组序列，我们采 用RT一PCR的方法，从骨折病人关节软骨细胞基因组中特异性扩增出 CILP基因组氨基端的前半部分cDNA序列(C1,64一999bp)，和后半部分 cDNA序列(C2,976一2031坤)，并且进一步将C2亚克隆成三个首尾互相 重叠的小片段，分别命名为C2F1(396bps,976by一1371冲)、CM (399 bps,1327by一1725bp)、C2F3(351bps,1681by一2031bp)，其PCR产物 经双脱氧基因测序加以确定。 2.CILP基因重组融合蛋白的构建:我们将Cl(999bp),C2(1,056 bp),C2F1(396bp),CM (399by)，以及C2F3(351by)的cDNA经 PCR扩增后的产物与载体pTEX一2一eHis(pEX质粒的衍生物，其狡基端含 有六个组氨酸残基，可便于亲合层析)质粒连接，然后，这些融合载体被重 组人大肠杆菌POP2136菌株中构建了CILP一p一半乳糖昔酶(CILP一p- 脚)重组融合蛋白。为了更好的研究CILP的免疫学抗原表位，我们进一步 采用pMAL一eHis(pMAL一C2质粒的衍生物，赦基末端多克隆位点带六个 组氨酸残基，可便于亲合层析)为新的表达载体导人大肠杆菌DH5a菌株 中重新构建了CILP各片段的CILP一麦芽糖结合蛋白(CILP一MBP)重组融 合蛋白。其插人子DNA序列经双脱氧基因测序和电泳加以确定。 3.CILP基因重组融合蛋白的提纯:细菌裂解液中的重组蛋白被用亲和 层析的方法提纯，以SDS一PAGE,WesternBlot鉴定重组蛋白性质。提纯后 的重组蛋白浓度用Bradford方法加以检测。 二、骨关节炎和类风湿性关节炎中CILP自身免疫作用的研究 1.骨关节炎和类风湿性关节炎病人血清中CRY自身抗体的检测:用 酶联免疫吸附试验和WesternBlot方法检测了105例骨关节炎和88例类风 湿性关节炎病人和正常对照组人群的血清标本。 ·2 · 2.CILP融合蛋白对小鼠的免疫:采用CILP一p一脚重组融合蛋白为 抗原对DBA/1J,ICR,C57BL/6及BALB/c4种小鼠进行免疫，观察其关节 部位的病理变化，并对其病变关节进行组织化学染色检查。 三、CILP重组融合蛋白诱发的C57BL/6小鼠关节炎模型的建立一CILP 关节炎性抗原表位的研究 1.C57BU6小鼠关节炎模型的建立:我们用CILP对小鼠进行免疫，从 而诱发了多发性关节炎的病理表现，进一步分别用CILP各片段抗原多肤来 免疫C57BL/6小鼠，利用MHC纯合型小鼠C57BL/6来研究CILP基因组中 的关节炎性抗原表位。 2.小鼠体内针对CILP的细胞增殖和体液免疫反应 3.小鼠病变的关节部位X光检查 4.CILP免疫小鼠体内的NTPPHase活性检测 实 验 结 果 一、CILP基因重组蛋白的亚克隆构建及诱生表达 I.人CILP基因的亚克隆及基因重组融合蛋白的构建:核酸电泳及SDS 一PAGE,WestemBlot、基因测序结果表明我们成功地构建了CILP一p一列 和CILP一MBP重组融合蛋白。 2.CILP基因重组融合蛋白的提纯:SDS一PAGE,WesternBlot结果均 表明这些重组蛋白片段均含有目的基因和块基末端的六个组氨酸残基，其 纯度满足我们实验的需要。 二、骨关节炎和类风湿性关节炎中CILP自身免疫作用的研究 1.骨关节炎和类风湿性关节炎病人血清中CILP自身抗体的检测:在 105例骨关节炎病人中有I1例病人(10.5%)对C2片段有血清自身抗体阳 性反应，88例类风湿性关节炎病人中有7例(8.0%)阳性，而对于C1片段 二者几乎均呈阴性反应。 所有的C2F1,C2F2和C2”片段都存在有自身抗原表位，骨关节炎病 人对CM 片段反应更为强烈，而在类风湿性关节炎