AT9810对K562、IL6白血病细胞系生长抑制作用的研究.pdfVIP

论文l AT981 0的提取分离 研究生：冯长伟 导师：潘祥林教授 前言 化学药物治疗白血病已有几十年的历史，并成为目前治疗白 血病的重要手段之一。但化疗药物毒、副作用较强，且对机体起 重要防御作用的淋巴细胞、骨髓造血细胞的破坏较大，使机体对 肿瘤及病原微生物抵抗力降低。临床上许多白血病患者死于肺 炎、败血症、尿毒症等化疗毒副作用及并发症。近二十余年来， 某些研究者以中医理论为基础，从中药中提取有效成分并进行实 验研究，发现某些中药确有其效，不仅能直接杀伤白血病肿瘤细 胞，还有诱导分化和促凋亡作用，并且不破坏正常细胞，甚至能 升高白细胞，提高机体免疫功能“。“。因此，从中药中提取有效 的天然药物治疗恶性肿瘤，成为目前的研究热点之一。为此，本 研究从抗癌中药中筛选出延命草。为探讨其对人白血病细胞的作 用及机理，并为治疗白血病提供理论基础，首先从中提取抗癌有 0。 效成分AT981 材料与方法 一．试剂及仪器 1．延命草：购自山东省药材公司，鉴定合格。 2．95％乙醇：购自济南酒精总厂。 8 3．硅胶粉(120-1 0目，柱层析用)，硅胶G(薄层层析用)：青 岛海洋化工厂生产。 4．AT9810对照品(含量98％)：购自河南中医学院化学教研室。 5．石油醚、丙酮、甲醇、氯仿、无水乙醇，均为分析纯(Analytical Reagent)，国产试剂。 6．多能式提取机组(50型)：武汉医疗器械厂生产。 二．方法 1．乙醇提取 延命草5Kg，分装于纱布袋中，分次放入多能式提取机组提 取罐中，分次加入相当于延命草10倍重量的95％乙醇，浸泡2 小时后，加热提取2小时。待提取罐冷却后，将提取后的延命草 沥干酒精弃掉，将提取液加热回收乙醇，得绿褐色粘稠膏体，浸 膏重280克。 2．脱色 将浸膏280克加热溶于2000mL无水乙醇中，加入粉状活性 炭5og，加热回流脱色0．5小时，减压抽滤后除去活性炭，将滤液 继续减压浓缩，得浸膏2559，将其分成2份，每份加入适量热水 混匀，使之成为混悬液，加入400mL石油醚萃取，减压抽滤回收 石油醚(可反复回收利用)，共4次，以除去石油醚中的色素成 分。将混悬液水浴加热浓缩成浸膏2509。 3．拄层析分离 3．1吸附剂的处理将一定量的柱层析硅胶装入一大瓷盘中，置 烘箱中于1o0—120℃活化2小时后，取出放置室温即可装柱。 3．2装柱与上样取浓缩脱色后浸膏809，加入适量无水乙醇水 浴加热溶解，加入909柱层析硅胶充分搅拌均匀，在水浴上拌炒 至细干粉状取出，凉至室温备用。 取柱层析用玻璃柱一只，柱高150cm，直径8cm，用适量药棉 和滤纸垫入底部。将处理好的柱层析硅胶2009，加入石油醚 700m1，搅拌均匀后倒入柱中，沉降2h后可上样。上样时将细粉 状样品均匀撒于硅胶柱上，使上层和下层各在一水平面上。沉降 2h后，上层再加适量硅胶(与适量石油醚拌匀)压住，再加少量 脱脂棉即可。 3．3 洗脱 洗脱液为一定比例的石油醚一丙酮，洗脱流速为 10一1 5： 5ml／min，洗脱梯度按石油醚一丙酮的比例分别为：1：0，9 收集，反复洗脱，直到收集液无色，洗脱物无结晶为止。用薄层 层析跟踪检识，将相同流份合并，并回收溶剂。回收后的溶剂可 反复使用。每次用5：5比例的石油醚一丙酮溶解洗脱物后，转移 至清洁小瓶内并编号，待结晶析出。 4．薄层层析分析 4．1薄层层析板的制作取吸附剂硅胶G粉末适量，放入研钵中， 加入适量o．5％羧甲基纤维素钠(o．5％CMNa)，充分研磨至稀糊状， X 均匀涂布于玻璃板上(10cm5cm)，厚度为0．5mm，放室温干燥 后于105℃活化1h后备用。 4．2