肺炎链球菌HMGCoA合成酶和还原酶基因克隆表达及功能研究.pdfVIP

摘要 近年来由于环境污染和抗生素的乱用而造成多药抗性的肺炎链球菌菌株逐年增加，抗性逐年增 强。深入研究肺炎链球菌等革兰氏阳性球菌致病机理和代谢过程十分重要，将为新的抗生素研 发提供新的作用位点或靶标。现代微生物学研究表明甲羟戊酸的代谢过程是肺炎链球菌等革兰 pathway)；l皂种潜在的药物作用靶标。我 氏同I性球菌生长所必需的，甲羟戊酸途径(mevalonate 代谢的作用机理，从而阻止病原菌赖以生存的甲羟戊酸代谢途径。 本研究以肺炎链球菌为材料，采用基因：r=程技术克隆表达了肺炎链球菌HMG．CoA合成酶 测方法对用分子对接技术和网格计算技术在化合物数据库中进行高通量虚拟筛选出的抗生素先 导化合物进行了实际筛选。本文主要得到以下研究结果： 1．从肺炎链球菌基因组DNA中克隆了HMGS基因，基因序列分析表明：该基因与文献中报 达。该基因编码蛋向由398个氨基酸组成。 8℃0．4mM 2．通过优化重组HMGS的表达条中l：，在1 IPTG诱导表达4h，利刚Ni．NTA层析柱 发现：该酶最适pH 析表明：该酶Vmax和Km分别为4．69I．tmol／min／mg和Km为2139M。 3．从肺炎链球菌基冈组DNA中克隆了HMGR基冈，该基冈与文献中报道的肺炎链球菌HMGR lPTG 码蛋白由424个氨基酸组成。构建了克隆重组表达载体pET-HMGR，在30℃经1mM 诱导表达，Ni-NTA层析柱分离纯化后获得了47kDa的特异性蛋白。动力学分析表明肺炎链 球菌HMGR的最适pH 6．5时的Vmax和Km分别 纯化后比活为31．981．tmoVmin／mg，比活提高2．8倍。在37℃，pH 活性。 了链球菌HMGS和HMGR的同源模建。采JHj计算机分析三维结构，川同源模建的方法寻找 结构类似物米研究新药的开发是一个新的领域。本研究分析了肺炎链球菌HMGS和HMGR 的三维结构，根据其同源模建和三维结构，利用分子对接技术和网格计算技术在化合物数据 库中进行高通鼍虚拟筛选竞争性抑制剂。 5．建立了采川重组肺炎链球菌HMGR筛选抑制剂苗头化合物的生物活性检测方法。对利川分 子对接技术和网格计算技术在化合物数据库中进行高通量虚拟筛选出的30种苗头化合物进 行了实际筛选。初步分析结果表明：在候选的30种苗头化合物中，筛选到一种比传统的竞 争性抑制剂洛伐它汀具有更佳抑制效果的1O号抑制剂，其抑制常数Ki为76州，而洛伐它 汀的抑制常数Ki为3539M。筛选到的该化合物通过进一步的药理、毒理、临床研究，有望 研发成为治疗革兰氏冈I性球菌的新药物。 6．洛伐它汀是HMGR的竞争性抑制剂，对肺炎链球菌HMGR具有一定的抑制效果，而洛伐它 贵，极火地限制了实际筛选，通过克隆表达的重组HMGS酶促反应的产物代替HMG．CoA 进行苗头化合物筛选效果较好。重组HMGS酶促反应的产物可以对大量候选的苗头化合物 进行初筛，可降低筛选成本，有利于寻找新砸高效抑制先导化合物，为研发可川丁治疗肺炎、 脑膜炎、败血症、菌血症等疾病的新型抗生素先导化合物奠定基础。新型高效抗生素药物一 ．口．研发成功，将有着良好的应川前景。 关键词：肺炎链球菌；HMGS；HMGR；克隆表达：酶特性鉴定；同源模建；抑制剂筛选 博士学位论文 ⑨DoCToRALDISSERTATIoN Abstract isthe bacteria severeinfectionssuchas Streptococcuspneumoniaemajorpathogeniccausing and recent has resistanceto meningitis，septicemia pne