蛇床愈伤组织形态发生过程中过氧化物酶的变化规律研究.DOCVIP

临床医学论文-蛇床愈伤组织形态发生过程中过氧化物酶的变化规律研究 【摘要】? 目的：研究蛇床愈伤组织形态发生过程中过氧化物酶活性的变化与过氧化物酶同工酶的差异。方法：采用分光光度法测定过氧化物酶活性，采用聚丙烯酰胺凝胶平板电泳分析过氧化物同工酶。结果：已分化愈伤组织的酶活性高于未分化愈伤组织，未分化愈伤组织、产生胚状体的愈伤组织及分化芽和根的愈伤组织的酶活性成线性递增关系。不同分化类型愈伤组织的过氧化物酶同工酶谱有明显的差异。三类愈伤组织都有酶带1和2，分化的愈伤组织都有3和5，分化芽和根的愈伤组织还有酶带4，分化芽和根的愈伤组织的酶带3比形成胚状体的愈伤组织的酶带3要宽，着色也深。结论：过氧化物酶活性与愈伤组织分化程度呈正相关；酶带1和2显示的两种同工酶与愈伤组织的增殖有关，酶带3和5是与分化有关的特异性蛋白质。酶带4可能催化器官发生特有反应，且对过氧化物酶的活性影响较大。 【关键词】? 蛇床；愈伤组织；过氧化物酶；同工酶 ?? 植物组织培养过程中形态发生的途径有两条，一是器官发生，一是胚胎发生。器官发生是由愈伤组织产生不定芽和不定根，进而形成植株；胚胎发生则是与合子胚相似的胚胎发生过程，由愈伤组织先形成胚状体，再由胚状体发育成完整植株。由于胚状体具有产生数量多、速度快、结构完整的特点，所以其理论和应用研究受到很大的重视。形态特征的变化是生理生化变化的外部反映，决定着分化和形态建成的方向［1］。建立胚状体发生的生化标识系统，通过改变外界因素诱导代谢向着有利于胚胎发生的方向进行，具有重要的意义。本实验以蛇床幼茎愈伤组织为测验材料，分析比较了未分化愈伤组织、分化不定芽愈伤组织与分化胚状体愈伤组织在过氧化物酶活性和过氧化物同工酶谱方面的差异，为分化机理的研究提供参考依据。 ??? 1?? 材料与方法 ??? 1.1?? 实验材料 ??? 供试材料为不同发育阶段的蛇床幼茎愈伤组织。未分化愈伤组织取自MS+2，4-D 1 mg/L +KT 0.4 mg/L培养基；分化不定芽愈伤组织（包括初生分化芽的愈伤组织和已分化芽及根的愈伤组织）取自MS+2，4-D 0.2 mg/L+ZT 0.4 mg/L培养基；分化胚状体愈伤组织取自MS+NAA 0.2 mg/L+ZT 0.4 mg/L培养基。 ??? 1.2?? 实验方法 ??? 1.2.1?? 过氧化物酶的活性测定［2］ ??? 参照章骏德等编著的《植物生理实验法》，取分化程度不同的愈伤组织各1 g，冰浴研磨成匀浆，定溶至25 mL，1 000 rpm冰冻离心，取上清液1.0 mL，加pH 5.0的醋酸缓冲液1.0 mL，0.1%愈创木酚1.0 mL，0.08% H2O2溶液1.0 mL。在470 nm处测OD值，通过标准曲线计算酶活性。酶活性以每小时每克鲜重生成的4-邻甲基苯酚的量来表示。 ??? 1.2.2?? 过氧化物同工酶的测定［3~6］ ??? 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr.）和胶联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis.）在催化剂的作用下，聚合而成的具有三维网状结构的凝胶。通过改变Acr.单体的浓度和交联度，可以控制凝胶孔径的大小。在不连续电泳过程中，通过样品的浓缩效应、凝胶分子筛效应以及一般分离的电荷效应，把酶、蛋白质混合物浓缩成区带、分离。 ??? 本实验参照文献［3］的方法，采取Acr.单体浓度为7%的凝胶板（制胶配方见表1、表2），用酶活性测定中相同的材料及相同的方法制样，电泳，用联苯胺染色法染色。胶板照相记录，并制干板保存。 ??? 2?? 结?? 果 ??? 2.1?? 不同分化程度的愈伤组织过氧化物酶活性 ??? 测定结果见表3。不同分化程度的愈伤组织过氧化物酶的活性测定实验结果表明，分化芽和产生胚状体的愈伤组织，酶活性高于未分化的愈伤组织，说明过氧化物酶活性与愈伤组织分化程度呈正相关。 ??? 2.2?? 不同分化程度愈伤组织过氧化物同工酶的变化 ??? 不同分化程度愈伤组织过氧化物同工酶谱成规律性变化，结果见图1。图1中a为未分化的愈伤组织的过氧化物同工酶谱，b为初生分化芽的愈伤组织的同工酶谱，c为已分化芽和根的愈伤组织同工酶谱，d为产生胚状体的愈伤组织的同工酶谱。 ??? 3?? 讨?? 论 ??? 一般认为，过氧化物酶的生理作用有三个：①具有吲哚乙酸氧化酶的作用；②具有木质化作用；③具有对创伤、照射的保护作用。无论是分化芽还是分化胚状体，都需要维管系统的建成，而过氧化物酶能使植物组织中所含C3-C6化合物转化成木质素，从而促进芽和胚状体的发育。由此可见，过氧化物酶活性是组织分化的一项重要指标［8］。芽分化时总是伴随着过氧化物酶活性的增加。丁宝莲等［7］在研究烟草叶肉细胞壁过氧化物酶时发现其活性从幼嫩叶片到成熟叶片，有一个从低到高、呈S形变化的曲线。徐竹筠［8］对胡