腺病毒介导血管内皮生长因子B基因转染慢性缺血心肌血管新生研究.pdf

万二书甲三大攀协士子位论大 申文抽县 月川试明阵专业 月- 目‘ 摘 要 缺血性心脏病IH‘D，是当代人类发病率和致死率较高的疾病之一冬于冠状 动脉的狭窄和闭塞产生组织供血和供氧缺乏，产生心绞痛、心肌梗死、心律失常、心 功能衰竭和碎死，目前主要的治疗措施是开胸手术进行冠状动脉旁路移植 (CABG), 经皮腔内球囊血管扩张 (PTCA)或者药物治疗，尽管已取得了很大的进步，但仍有 约5%的患者因严重而弥漫的病变、缺乏血管桥和吻合血管以及高手术危险等而不适 合以上的治疗措施。 各种血管生长因子的相继发现给 IHD患者的治疗带来了希望，心肌缺血可诱导 一些生长因子的产生形成一定数目的侧枝血管，但不能满足自身的需要，研究者开始 尝试增加缺血区生长因子浓度的方式，以其通过增加侧枝血管的生长而减轻心肌缺 血、预防心肌梗死和保存心脏的功能，即 “治疗性血管新生”(Therapeutic Angiogenesis)，近年的研究预示这将为IHD的治疗提供一条全新而有效的途径。 目前研究的血管生长因子主要集中在血管内皮生长因子 A (VEGF-A)、成纤 维细胞生长因子 (FGF)和血管形成素 a〔ngiopoietins)等，由于各自的生物学特性和 作用特点不同，缺乏相互比较，尚不能确定何者为首选。新近发现的血管内皮生长因 子B(VEGF-B)结构与VEGF-A相似，分布广泛，在心脏较为丰富，与VEGF家族 的受体之一VEGFR-1和neuropolin-I结合，研究表明内皮细胞和其周细胞存在编码 VEGF-B的mRNA,VEGF-B能够促进培养的血管内皮细胞 (ECS)的生长，并增加 纤溶酶的活性从而调节血管外基质的降解、细胞粘附和迁移，敲除VEGF-B基因的鼠 心脏体积减小阻塞冠状动脉后的恢复受限，提示该因子影响冠状血管的发育和生长， 提示有潜在的治疗作用。与VEGF不同的是，缺氧并不明显增加VEGF-BmRNA的 表达，缺血心肌 VEGF-B的缺乏可能是内在血管生长不足的原因之一，目前关于 VEGF-。的血管新生作用的研躺未见报道少一‘ 基因治疗是目前研究的热点，腺病毒介导的基因转移优于直接应用蛋白和质粒 载体，为了探讨腺病毒介导VEGF-B基因对缺血心肌的血管新生作用，我们首先构建 了编码人VEGF-B基因的复制缺陷的重组腺病毒 (Ad.VEGF-B)载体，在体外研究证 实对血管内皮细胞具有促增殖作用的基础上，直接注射猪慢性缺血心肌以评价在体应 用的效果。 J阵二书暇巨大拳娜士娜位t仑J气 中大摘要 月尹笔外科专业 ‘‘~，州 腺病毒粘粒载体 (pAxcAw/tVEGF-BcDNA)的构建 抽提人心肌组织总RNA,经RT-PCR合成VEGF-BcDNA，扩增后酶切鉴定， 将纯化的目的基因插入测序载体PUC119，转化感受态大肠杆菌TG，进行扩增和抽提， 获得正确的目的基因VEGF-BcDNA，插入有腺病毒基因组的粘粒载体pAxcAwl，扩 增后挑选插入方向正确的克隆. 2.VEGF-B基因重组腺病毒载体Ad.VEGF-B的构建 应用磷酸钙共沉淀法将DNA-TPC和重组粘粒pAxcAwtfVEGF-BcDNA转染293 细胞，培养 8-18天后挑选病毒克隆，同样的方法构建表达大肠杆菌0一半乳糖昔酶 的LacZ基因腺病毒载体，经限制性内切酶酶切鉴定正确的病毒克隆进一步扩增后氯 化艳梯度超速离心，应用TICDS。法测定滴度。以Ad.LacZ感染Hela细胞，经X-gal 染色确定转染效率，并初步观察转染后细胞生长和形态评价其毒性。 3.AdNEGF-B体外转染心肌细胞和对血管内皮细胞促增殖作用的研究 分离培养胚胎鼠心肌细胞 (FCM)和成鼠主动脉内皮细胞 (RAECs)，免疫组化 鉴定，分别以不同MOI(每个细胞的病毒噬斑形成单位pfulcell)值的Ad.LacZ转染 FCMs,RAECs，应用X-gal染色测定转染效率，以MOI值20的AdVEGF-B感染FCMs 和RAECs，以Ad.LacZ,PBS为对照，转染后l,3,7天进行RT-PCR检测其转录， 同时应用 WesternBlot检测转染后细胞培养上