脐血干细胞分离，玻璃化冻存和活率检测研究.pdf

矛形工大华2002窟解士华fir护丈 摘 要 渝 血中造血细胞的数量和质量都与骨髓相近，而且，具有来源丰富、无病原体污染、 抗翩 ,胜弱、淋巴细胞不成熟等优点。随着对脐血研究的深入，脐血的进一步开发利用展 现出诱人的前景护，产一 本文研究了脐血的两种不同分离方法:Ficoll法和HES法。比较了这两种方法的回 收率。同时得出:于24小时内分离的脐血干细胞可以保持较高的活率，在93%以上。 在此基础上，本文以HES法分离所得的脐血干细胞作为材料，进行玻璃化法超低温 保存，目的是探索最合适的保护剂浓度和最合适的预处理时间，以期细胞冻融后获得较 高的活率。 (9血的广泛应用有赖于脐血库的建立。而有效的冻存方法，是脐血库建库中相当重 要的一个环节。目前，脐血的冻存主要采用程控降温法，但由于其操作繁琐，且需要价 格昂贵的程控降温仪，难以在生物工程领域得到普遍的推广和应用。近些年来兴起的玻 璃化法超低温保存，以其简单、快速等优点，有望在脐血干细胞的保存方面展现良好的 应用前景。 玻璃化法是指受高浓度复合保护剂处理后的细胞连同保护剂本身都进入一个均一 的无冰晶的玻璃化状态，冰冻保存的细胞受到损伤较小，存活率较高。它是一种简便、 有效、成本低廉的超低温保存方法少 a 本文采用系列浓度 (10%,20%,40%,60%,80%,100%)的PVS2保护剂预处 理不同的时间(5,10,15,20,30,40分钟)，然后在完全浓度的玻璃化保护剂中直接 投入液氮。低融后的细胞经过MTT检测和FDA-PI双荧光染色法检测，获得预处理过 渡的优化条件，即60%浓度的保护剂，预处理15分钟，此时的FDA/PI值为46.43犷- 本文还将海藻糖取代原保护剂中的蔗糖。保用以上的优化条件:60%保护剂浓度， 进行不同时间的预处理。冻融后的细胞以FDA-PI双荧光染色、流式细胞仪CD34十计数 等检测手段，与同样条件的60%蔗糖保护剂处理的细胞相比较。两者在预处理时间为 15分钟时的FDA/PI值分别为55.83和46.43，很明显，海藻糖要比蔗糖高出20.25%. 而两者在预处理时间为巧分钟时的CD34十回收率则分别为57.26%和31.62%,亦是前 者高出后者25.64%.由此可见海藻糖的低温保护作用明显优于蔗糖。厂v 本文得出结论如下: 1)HES法分离脐血干细胞的回收率明显高于Ficoll法。 2)24小时内分离脐血干细胞可以保持93%以上的活率。 3)60%浓度的保护剂 (PVS2),15分钟预处理时间，是玻璃化冻存脐血干细胞的 最适条件，FDA/PI值为46.43. 4)以海藻糖取代原保护剂中的蔗糖， 同样的处理条件下，FDA/PI值高于后者 20.25%,CD34+回收率高于后者25.64%. 关键词:脐血干细胞;分离;玻璃化冻存;活率检测;海藻糖 熟 };x}}zaoz}aa}r}}.zxe.-x ABSTRACT Thequantityandqualityofhematoblastinumbilicalcordblood(UCB)canbecomparedwithbone marrow.Furthermore,ithasotheradvantages:widelysourced,nocontaminationofpathogeny,weakly antigenicity,andnomaturelymphocyte,etal. Inthispaper,wecomparedtheregain-rateoftwokindsofprocedureforseparatingUCBstemcells: withFicollandwithHES.Obviously,theprocedurewithHESisbetterthantheformer.Also,wefoundthat theUCBstemcellswouldremainahighsurvival-rateifitisseparatedwithin24h,above93%. Withthedevelopmentofumbilicalcordblood(UCB)bank,howtopreservetheUCB