类风湿性关节炎患者外周血hMLH1启动子CpG岛甲基化初步研究及DNA甲基化法医学应用探讨.pdfVIP

中文摘要 类风湿性关节炎患者外周血hMLHl启动子CpG 岛甲基化的初步研究及DNA甲基化 的法医学应用探讨 摘 要 Arthritis，RA) 目的：类风湿性关节炎(Rheumatoid 是一种难治性疾病，在我国患病率约为0．3％，是一种全 身性自身免疫性疾病，以非化脓性、增生性滑膜炎病变 为主，逐渐导致关节软骨的破坏，最后造成关节功能的 障碍及多器官、多组织受累。目前，类风湿性关节炎的 病因尚未阐明。许多研究认为，遗传和环境因素是主要 的病因。现有研究表明，RA患者普遍存在基因组DNA 低甲基化，而基因组DNA低甲基化可能使RA患者的某 些基因的表达异常，此种机制可能与疾病的发生发展有 关。 真核基因表达的调控发生于多阶段水平，即基因组、 转录、转录后、翻译和翻译后等5个阶段水平。精确调 控机制之一是DNA甲基化。这是一种从遗传过程中获 得的使DNA发生化学变化的渐进性调控过程，DNA甲 基化发生在DNA复制之后，转录之前。其基本过程是 在DNA甲基化酶的催化下，从S．腺苷酰．L．甲硫氨酸 (SAM)上转移甲基到胞嘧啶环的第5位碳原子(或腺 嘌呤环的N6位)上(生成5．甲基胞嘧啶和6一甲基腺 嘌呤)，从而得到甲基化DNA。DNA甲基化与抗核酶的 中文摘要 抗性、细胞防御机制、基因激活与印记、细胞的分化与 发育。以及衰老和癌变相关。 DNA错配修复(mismatch repair，MMR)是重要的突 变避免系统，它通过校正正常DNA代谢中产生的碱基错 配及调节DNA损伤所诱导的凋亡来维持基因组的稳定 性。错配修复为细胞准确复制和增殖所必须，若错配修 复系统异常，细胞突变频率可增加100倍以上。人体细 胞中DNA错配修复反应过程依赖于几种人类MMR基 因产物的参与，因此，其中任何一种基因发生突变导致 其产物功能的丧失都将造成DNA错配修复功能的异 常、缺陷或丧失。 目前人类的错配修复(mismatch repairenzyme，MM mut．1 其中hMLHl(human 类错配修复系统中功能最重要的一个基因，主要作用是 保持遗传物质的完整性和稳定性，保证DNA复制的忠 实性。如果这些错配修复基因功能发生缺陷或活性降低， 复制过程中出现的错误不能及时被纠正，就会导致微卫 星不稳定(Microsatellite 个基因组不稳定，随机突变率增高，从而引起疾病的发 生。 有研究显示，hMLHl表达的缺失与此基因启动子胞 嘧啶甲基化直接有关。在Leung等的研究中，90％以上 发生hMLHl甲基化的散发性胃癌病例同时伴有hMLHl 中文摘要 蛋白的表达缺失，提示甲基化是导致hMLHl基因转录 期分子活动，可导致mRNA或蛋白表达降低，影响 hMLHl修复功能的正常发挥，使相关基因突变不能及 时有效纠正，最终促使疾病发生。然而，类风湿性关节 炎患者hMLHl启动子CpG岛甲基化状态如何，国内外 尚未见报道。本实验以人外周静脉血为研究对象，研究 hMLHl基因在类风湿性关节炎病人的甲基化情况，并在 转录及蛋白水平观察该基因的表达情况。目前，DNA甲 基化也是法医学的研究热点。本实验又结合DNA甲基化 自身的特点，探讨其在法医学领域的应用前景。 方法：采取RA患者外周静脉血，密度梯度离心法 分离出外周血单个核细胞，提取RNA；全血提取DNA 及核蛋白。 RT-PCR、WesternBlot方法检测外周血hMLHl mRNA及蛋白表达。所得结果用Gel．pro凝胶分析软件进 行半定量分析。采用亚硫酸氢钠(SodiumBisulfite)方法处 验分为两组：健康人对照组和RA患者组。 SPSS 11．5统计分析软件进行分析，行#检验或Fisher’ ．s确切概率法检验和Spearman等级相关分析，均数的比 较行秩和检验。 结果：l 38例