蓝萼甲素抑制血小板活性和血栓形成机制研究.pdf

蓝萼甲素抑制血小板活性和血栓形成的机制研究 摘 要 摘 要 血小板在动脉粥样硬化以及各种血栓栓塞等心脑血管疾病中发挥了举足轻重 的作用。研究证明抗血小板药物能够用来预防及治疗各种血栓栓塞的急性临床事 件。而草药成分被认为是开发抗血小板药物的重要来源。蓝萼甲素（glaucocalyxin A，GLA ）是从唇科香茶菜属植物香茶菜〔Isodon japonica （Burrm F ）Hara var glaucocalyx (Maxim) Hara 〕中提取分离出的一个二萜化合物。蓝萼香茶菜为民间药， 性味苦、寒，具有健胃、清热解毒、活血、抗菌消炎等活性。现代药理研究表明， 蓝萼香茶菜的乙醇提取液能减轻心肌缺血-再灌注损伤，保护心肌；GLA 可以通过 抗血小板作用起到活血、心肌保护作用，如可抑制卡西霉素刺激的兔血小板生成 血小板活化因子，能抑制花生四烯酸诱导的兔血小板血栓素A2 生成，并同时升高 前列腺素E ，能显著抑制ADP 、AA 和PAF 等诱导的兔血小板聚集，显著升高血 2 86 小板内cAMP 水平，能增加机体对 Rb 的吸收，改善微循环作用。最新研究发现 GLA 还能通过线粒体途径诱导癌细胞凋亡。因此，本论文我们进一步证明了GLA 具有抗血小板作用，并阐明了GLA 抑制血小板活化的分子机制。 利用新鲜分离的健康志愿者提供的外周血，我们制备了洗涤血小板用于检测 GLA 对血小板活化的影响。血小板聚集实验结果显示，GLA 在浓度为0.001μg/ml 与0.01μg/ml 时就能显著抑制胶原诱导的血小板聚集（P 0.001 和P 0.001 ），而 对其他血小板刺激剂，诸如 ADP 、thrombin 、U46619 （TXA2 模拟物）刺激的血 小板聚集无抑制作用，提示GLA 对胶原诱导的血小板聚集具有一定的选择性、专 一性。提示 GLA 主要是通过作用于血小板表面糖蛋白受体 GPⅥ通路来起到抑制 血小板聚集的作用的。 为进一步从细胞以及分子水平探讨GLA 对血小板活性影响的机制，本论文研 究了 GLA 对血小板活化信号通路的影响。胶原蛋白与 GPⅥ结合后，可引起 Src 家族信号蛋白向GPⅥ胞内部位募集并磷酸化，磷酸化后的 Src 可与GPⅥ胞内部 位协同作用，导致Syk 的磷酸化进而活化PLC γ2；通过一系列信号传递，血小板 活化并可发生形变、黏附、释放。胶原蛋白受体 GPⅥ信号传导途径的 Src、Syk 和PLCγ2 酪氨酸磷酸化的抑制作用。 I 摘 要 蓝萼甲素抑制血小板活性和血栓形成的机制研究 研究还发现GLA 能够降低胶原蛋白刺激的AKT, ERK 和p38 磷酸化；由于 AKT 是PI3K 通路的标志，ERK 和p38 是MAPK 通路的信号蛋白，所以我们认为 GLA 也能够抑制PI3K 通路和MAPK 通路。流体小室实验能够在体外模拟体内血 管壁损伤导致胶原蛋白暴露，血小板黏附在损伤部位，形成血栓的病理生理过程。 在本论文的第四章，通过流体小室实验，证明蓝萼甲素（GLA ）能够抑制血小板 粘附于胶原蛋白的表面。 此外，我们通过凝血酶（thrombin ）和蛇毒素(convulxin, CVX)诱导的p-selectin 分泌 (P0.01) 和 Pac-1 结合实验 (P0.01)，证明GLA 在浓度为0.5μg/ml 时能够 抑制血小板由内向外的信号传导。我们还通过凝收缩块（clot retraction ）实验，证 明了GLA 能够抑制血小板活化过程中由外向内的信号传导。 总之，本论文初步阐明了GLA 能够通过影响血小板糖蛋白VI 信号通路抑制 血小板活化的分子基础。为开发GLA 作为一种新的抗血小板药物，提供了有价值 的实验依据。 关键词:蓝萼甲素；抗血小板聚集；分子机制，信号通路 作