从原始生殖细胞中分离克隆牛胚胎干细胞.pdfVIP

从原始生殖细胞中分离克隆牛用阴台干细胞 硕士研究生:李松 指导教师:窦忠英教授 (西北农林科技大学家畜生殖内分泌与胚胎工程农业部重点开放实验室，陕西杨凌712100) 摘 要 采用与同源胎儿成纤维细胞共同培养及传统饲养层培养方式，以高糖DMEM 添加O.ImM2-疏基乙醇，犊牛血清，细胞因子为培养基，以4-13周龄屠宰牛胎儿 为实验材料，探讨影响牛原始生殖细胞分离克隆胚胎干细胞的相关因素。实验结 果如下: ‘1.共收集50例牛胎儿。在操作过程中，有1。例污染;参与胚胎干细胞分离 克隆的40例牛胎儿中，一体长b.5cm的雌性胎儿胚胎干细胞传到 15代 (从0代 记起)。由牛原始生殖细胞分离克隆胚胎干细胞各代的形成率分别为:72.5%, 47.5%,42.5%,30%,22.5%,17.5%,17.5%,12.5%,12.5%x,10%,7_5%,5%, 5%,5%,2.5%,2.5%e)-e, 女‘ 牛胚胎干细胞分离与克隆时期的生长状况。牛原始生殖细胞培养12h时， 就会出现4-5个原始生殖细胞组成的小集落。培养至第7天，出现典型鸟巢状胚胎 干细胞集落。初次分离到的集落，可能因含杂细胞较多，一般呈黑色，褐色，多以山 包状，馒头状等形态存在。随传代数的增多，呈典型鸟巢状的胚胎千细胞集落相对增 多。 傲犊牛血清对牛胚胎干细胞分离克隆的影响。 把细胞培养液中犊牛血清浓度 分别设为:0%,5%,10%,15%,20%。结果发现:当犊牛血清为 15%时效果最 好。 丫细胞因子对牛胚胎干细胞分离克隆的影响。细胞因子添加与否对胚胎干细 胞的分离及同源牛胎儿成纤维细胞的贴壁与生长影响并不显著。而在传代过程中 有一定影响俘·中以添加LIF+SCF+bFGF一组效果最好。在实验中，添加复合因 子的牛胚胎干细胞平均最高传代数达 7.0，未添加组为4.5。三种因子的添加量分 m为*; ;5nglml:lOnm!leI `y.消化液对牛胚胎干细胞克隆传代的作用。把细胞消化液浓度分别设为:0.2% 胰酶:0.4%胰酶;0.04%EDTA: 0.2%胰酶+0.04%EDTA;0.4%胰酶 +0.08%EDTA。其中以0.2%胰酶+0.04%EDTA为最好。对细胞综合损伤力小，且 传代后胚胎干细胞的克隆能力也较高。 乙6·不同饲养层对牛胚胎干细胞分离传代的影响。与同源胎儿成纤维细胞共培 养，以及分别以经过丝裂霉素灭活过的胎牛肌肉成纤维细胞、胎牛辜丸成纤维细 胞、小鼠胎儿成纤维细胞、人胎儿成纤维细胞为饲养层比较，结果表明:以同源 胎儿成 细胞共培养的方式效果最佳 得到的牛胚胎干细胞，经碱性磷酸酶染色，体外分化实验，核型分析 及细胞核移植实验证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。 关键词:牛 原始生殖细胞 胚胎干细胞 分离克隆 IsolationandCloningofEmbryonicStemCells FromBovinePrimordialGerm Cells GraduateStudent:Lisong DirectiveProfessor:Douzhongying KeyLaboratoryofAnimalReproductiveEndocrinoloygnadEmbryoBiotechnologyofAgricultureMinistry ofChina.NorthwestScienceTechnoloygUniversityofAgricultureForestyYanglingShmnxi712100 Abstract