番茄花叶病毒弱毒疫苗ToMVK985KDa复制酶与运动蛋白转基因及其与抗病性相互关系.pdfVIP

摘 要 (植物病毒是农作物的主要病害之一，病毒侵染使农作物蒙受巨大的经济损失。植物病毒弱 毒疫苗在防治植物病毒病中发挥着重要的作用，当植物系统感染了病毒的某一株系后，可免受 同种病毒其他株系侵染。植物基因工程的出现与发展为植物病毒病的防治开辟了新的途径。 番茄花叶病毒弱毒疫苗 (TbMV-K)是将番茄花叶病毒强株 (L-TMV)用亚硝酸处理后， 分离筛选而得到的对TMV(包括番茄花叶病毒)感染有明显保护作用的弱毒株，具有稳定的免 疫特性和遗传性。在TbMV-K的基因组中存在98.5KDa复制酶基因和27KDa运动蛋白基因，对 该病毒的致弱分别起主要和次要作用。通过基因工程技术将TbMV-K98.5KDa复制酶基因和运 动蛋白基因分别导入植株，探讨98.5KDa复制酶基因与运动蛋白基因表达的蛋白与植物抗病性 的关系。同时将两个基因串联起来，构建双价基因导入植物，研究它与植物抗病性的关系，以 系统地进行了番茄花叶病毒弱毒疫苗(ToMV-K) 期为植物抗病毒基因工程提供一种新策略7C3 98.5KDa复制酶基因、27KDa运动蛋白基因及两者联合基因的克隆、原核表达以及转基因烟草 的抗病性研究。 通过PCR扩增获得番茄花叶病毒弱毒疫苗 (TbMV-K)98.5KDa复制酶基因和27KDa运 动蛋白基因。经EcoRV和SacI进行双酶解，将98.5KDa复制酶基因和27KDa运动蛋白基因分 别插入原核表达载体PET-30(a)得到重组质粒PET-Nr与pET-Nm了将两者各自转入表达菌BL21 中，通过工PTG诱导，超声波破碎菌体和SDS聚丙烯凝胶电泳，分析了番茄花叶病毒弱毒疫苗 (ToMV-K)98.5KDa复制酶基因和27KDa运动蛋白基因在大肠杆菌中的表达，结果表明重组 质粒pRNr与pRNm在原核细胞中得到高效表达。将表达产物 (包涵体)免疫家兔制备抗血清。 将重组质粒pRNr中98.5)(Da复制酶基因与pRN。中27KDa运动蛋白基因通过酶切定向插 入植物表达载体pRoKII中，获得重组植物表达载体pRNr和pRNmo禅过多次酶切将重组质粒 pRNm中27KDa运动蛋白基因插入植物表达载体pRoKII，获得重组质粒pR35SZ-Nm;再将重组 质粒pRNr经ScaI和BantHI酶切定向插入重组质粒pR35SZ-Nm中得到98.5KDa复制酶与27KDa 运动蛋白联合基因植物表达载体pR35SZ-Nm-Nr少 将植物表达载体pRNr,pRN。和pR35SZ-Nm-Nr通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草，转基因 烟草的PCR,SouthemDotBlot和WestemBI。检测分礴明:番茄花叶病毒弱毒疫苗T(oMV-K) 的98.5KDa的复制酶基因和27KDa的运动蛋白基因及两者的联合基因已整合到烟草基因组中。 对转基因烟草进行强烟草花叶病毒 (TMV)和弱番茄花叶病毒 (ToMV-K)的病毒侵染试验，结果 表明:3种转基因烟草对TMV和ToMV-K分别表现出不同的抗病性，抗性主要表现为症状出现 推迟严重度减轻。其中ToMV-K98.5KDa的复制酶和27KDa的运动蛋白的联合基因转化烟草表 现出较强的抗病性，表明我们的抗病毒基因工程新策略是可行的。少-一 关键词:ToMV-K 复制酶基因 运动蛋白基因 转基因植株 抗病性 Abstract Transgenicstudyon98.5KDareplicaseandmovementproteingenein attenuatedtomatomosaicvirus(ToMV-K) Postgradute:WeiJunya Tutor:ProfZhangJishu ProfQiuBingsheng (CollegeofLifeScience,NorthwestSci-techUniversityofAgriculturaandForestry, Yangling,Shaanxi,712100) Plantviraldiseaseisoneofthevitalviraldiseasesofcropsanditsinfectioncan makethecropstosuffer