人肝癌细胞系转移相关分子比较蛋白质组学研究.pdfVIP

博士论文 人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质组学研究 尿素，n=3),781土34个 ((8M尿素，n=3)。上述结果表明离液剂浓度改变对蛋白斑 点的获得影响较大。 不同固定时间(双胺银染法)影响蛋白质条带的显示，固定方式A(40%乙醇 10%乙酸固定1h，后5%乙醇5%乙酸固定过夜)条带显示最多;固定方式B(40% 乙醇10%乙酸固定lho)条带显示次之;固定方式C(5%乙醇5%乙酸固定过夜) 条带显示最少。固定方式A得到的蛋白质银染图谱理想，建议用于蛋白成分复杂 图谱的显示。 3种转移潜能不同人肝癌细胞系的蛋白质样品，在相同条件下分别进行3次 双向电泳，Hep3B平均检测到976士112个蛋白点 (n=3),MHCC97L平均检测到 1092+4。个蛋白点(n=3),MHCC97H平均检测到888土15个蛋白点(n=3)，以其中 点数最多的一块 MHCC97L图谱作为参考胶，Hep3B与其匹配的平均匹配点数为 637土37个(n=3),MHCC97L与其匹配的平均匹配点数为771土16个(n=2),MHCC97H 与其匹配的平均匹配点数为589土51个(n=3)，平均匹配率分别为65.7%,72.1%, 66.2%。不同胶间蛋白质斑点的位置偏差IEF(等电聚焦)方向为2.95土。.95mm, SDS方向为2.87+0.88mmeHep3B,MHCC97L,MHCC97H中有359个蛋白质点 匹配。与Hep3B比，MHCC97L有103个点未匹配，相差10倍以上的上调点有57 个，相差10倍以上的下调点有49个;MHCC97H有113个点未匹配，相差10倍 以上的上调点有47个，相差10倍以上的下调点有52个。质谱鉴定出S100A4, S100A6,S100A11,annexin1等26种胶内差异蛋白质。部分差异蛋白如annexinl 和S100A4等在转移与不转移人肝癌细胞系中为最新发现。由于转移性肝癌细胞 系全蛋白质表达谱与不转移人肝癌细胞系比差异明显，推测肝癌侵袭转移性与细 胞内多种差异蛋白的改变相关。 第二部分 转移潜能不同人肝癌细胞系差异蛋白的 再验证及功能分析 对差异蛋白annexinl和S100A4的功能解析是本研究的另一个重要目标。由 于两种差异蛋白是从转移与不转移的人肝癌细胞系蛋白质表达谱的差异比较中 筛选出来的，因此一系列与侵袭转移有关的细胞生物学功能的检测成为课题的重 点。 为保证差异蛋白初筛结果的可信及下游分析的确定性，我们首先对差异蛋白 结果进行T再验证，应用RT-PCR,Westernblot，细胞免疫化学证实annexinl 和S100A4的确在有转移潜能人肝癌细胞系 (MHCC97H和MHCC97L)中高表达。 采用反义 RNA技术策略，分别构建 PcDNA3.1(+)ASannexinl表达质粒和 博士论文 人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质组学研究 peDNA3.1(+)ASS100A4表达质粒，转染高转移潜能人肝癌细胞系MHCC97H，观 察annexinl和S100A4蛋白表达降低对MHCC97H细胞生物学行为 (包括运动、侵 袭、MMPs分泌、凋亡等)的影响。 侵袭实验显示穿过人工基底膜细胞数分别为:5.0+1.414(MHCC97H/ pcDNA3.1(+)ASS100A4),16.43+2,225(MHCC97H/peDNA3.1(+)ASannexinl)， 16.4土1.574 (MHCC97H/pcDNA3.1(+)),16.86土1.517 (MHCC97H)，转染 pcDNA3.1(+)ASSl00A4质粒的MHCC97H细胞穿过人工基底膜数目明显少于未转 染和转染空质粒 ((t检验，P0.05)。运动实验发现穿过上室底膜的细胞数分别 为:11.1土3.304 (MHCC97H/pcDNA3.1(+)ASS100A4),11.13土3.314(MHCC97H /pcDNA3.1(+)ASannexinl)，18.88土2.031(MHCC97H/pcDNA3.1(+))， 21.86 上3.388(MHCC97H)。与未转染和转染空质粒比，转染两种反义重组质粒的MHCC97H 细胞穿过上室底膜的数目均明显减少 ((t检验，PO.05)。上述结果说明S100A4 蛋白表达降低可显著影响肝癌细胞的运动侵袭能力，而annexinl则仅与肝癌细 胞的