庚型肝炎病毒非结构蛋白5A区基因片段的表达与结构分析.pdfVIP

庚型肝炎病毒非结构蛋白5A区基因片段的表达与结构分析 研究生姓名:龚齐 导师:马辉文教授 . (武汉大学生命科学院，武汉，430072) 摘要 对应于庚型肝炎病毒 (GBV-CIHGV)NS5A区中的一段cDNA 片段 (NS53cDNA)，被亚克隆于表达载体PGEX-5X-11，使之位于编 码}1本血吸虫谷胧甘肤硫转移酶 (GST)的DNA序列下游，并与GST同 框。在37℃下经乳糖诱导，此融合蛋白基因在大肠杆菌BL21(DE3)菌 株中被过量表达，得到分子量约为60KD的GST-NS53融合蛋白。用服溶 法初步纯化了以包涵体形式存在的该融合蛋白。 免疫印迹分析证明，该融合蛋白能被庚型肝炎病人血清和制备的抗 GST家兔血言青特异性地识别。 诱导温度为37C、诱导起始ODw值为1.0, 冬,L一ARM1J{7c一一%{kMf}11A*isi911*续时问为5小时的条件下，以包涵体形式存 在的GS丁-NS53融合蛋白的表达量达到最高;诱导温度为200C:起始OD,, 值为 1.0.乳糖终浓度为0.1%和诱导持续时间为 i4小时的条件下，表达 的GST-NS53融合蛋白为具有GST生物活性的可溶性蛋白。提高诱导时 培养液的pH值稀提高所表达的舫蛋白中可溶性部分的比例。万 通过SephacrylS-200HR凝胶过滤层析对GST-NS53融合蛋白包涵体 尿索提取液进行变性条件一「的纯化。得到纯度为90%的GST-NS53融合 蛋白。对包涵体尿素提取液进行了复性。适用谷肤甘肤亲和层析柱纯化了 III溶性GST-NS53融合蛋白，纯度达到92%e 汤冬NS53cDNA核”酸及其编码的“基酸序列与已发表的GBV-CIHGV 各利.毒株的相应序列所作的同源性分析表明，NS53核营酸序列的3端和 氮毯酸序列的梭荃端与已发表的各毒株有较大的差异。通过对NS53蛋自 的结构分析，推浏NS53蛋白可能有两个保守性抗原决定簇，其中一个位 于推测的a一螺旋..L.可能构成NS53蛋白的免疫显位。NS53蛋白的氦丛 端和竣基端存在集中的 形成包涵体的原因之一卿’“““J,“JGST-NS53RkAT白““ 关键词:庚型肝炎病毒，NS5A基因，原核表达，抗原性 EXPRESSIONANDCHARACTERIZATIONOF NONSTRUCTURALPROTEIN5AGENEOF HEPATITISGVIRUS GradateStudent:GongRui Advisor:Prof.MaHuiwen (CollegeofLifeScience,WuhanUniversity,Wuhan,430072,China) AbstractA880basepaircDNArfagment(NS53cDNA)locatingatthe putativeNS5AregionofHGVgenomewassubclonedandexpressedin EscherichiacoliBL21(DE3).ThecDNArfagmentwasinsertedintoplasmid pGEX-5X-1,atthedownsrteamofthecodingsequencesofSchislosoma japonicamnglutathioneS-transferase(GST),inthesamereadingrfameasthe geneofGST.A60KDGST-NS53fusionproteinwasexpressedat37Cina formofinclusionbodies. TheGS5-NS53fusionproteincouldbespeciallyrecognizedwithboththe serarfomthepatientinfectedbyHGVandtheantiseradirectedagainstGST preparedinthepresentstudy. Theexpressionwasoptimizedtoachievethehighestexpressionlevelof GST-NSS3fusionproteineitherinaformofinclusionbodiesorinasoluble formwi