胚胎干细胞条件培养液促进兔角膜上皮细胞长期增殖实验研究.pdfVIP

本课题受国家高技术研究发展计划(863计划)“组织工程 金面上资助金(--等)“胚胎干细胞微环境对角膜上皮细胞衰老 过程影响的研究(20070410858)的资助。 英文缩写词表 tlIlII大学博Ij石出站撤：‘i 114：．胎r细胞条什培养液促进兔角膜l：皮细胞长期增殖的实验研究 胚胎干细胞条件培养液促进兔角膜上皮细胞长期增 殖的实验研究 流动站名称：基础医学 研究方向：干细胞与组织工程 博士后：刘颖 合作导师：王智崇教授 摘 要 目的 本研究旨在探讨胚胎干细胞条件培养液对兔角膜旁中央部上皮细胞牛物学 特性(如形态、增殖、CFE和细胞表型等)和功能(如复层)的影响，以期建立 一种利用少量自身细胞获得大量种子细胞的培养体系，从而满足组织工程器官构 建和细胞治疗的需要。 方法 利用组织块法取材并培养兔周边部角膜上皮细胞，设定对照I组为角膜上皮 常规培养液(高糖DMEM为基础培养摹)培养的细胞；对照II组为上述培养液 out 添加40％d,鼠ES细胞培养液(高糖KnockDMEM为基础培养基)培养的细 胞；实验组为角膜上皮常规培养液添加40％小鼠ES细胞培养上清液培养的细胞。 比较各组细胞的连续传代能力；倒置相差显微镜比较各组细胞的形态和生长情 l}IllI大学博Ij后m站撤；’r 胚胎T-细胞条件培养液促进兔角膜I-皮细胞长期增殖的实验研究 况：流式细胞仪测定细胞大小和死活染色分析：利用IV型胶原包被的培养板比 较各组细胞的粘附能力；MTT法测定牛长曲线：Giemsa染色观察细胞的克隆形 和ABCG2)的表达情况；秋水仙素法测定核型，注射裸鼠观察细胞致瘤性；气． 液刺激促进复层形成，HE染色观察复层形成情况，扫描电镜观察表面微绒毛情 beta 问、细胞一基质问连接--Desmocollin 4和基底膜成分 3、Occludin、Integrin 一IV Collagen表达。 结果 本研究成功建立了一种利用胚胎干细胞微环境促进细胞增殖的培养体系，研究 结果显示：经ES条件培养液培养的兔角膜上皮细胞具有高度的增殖活性，22周 内在体外连续传代超过55代，而两个对照组在体外生长均未达3代；实验组细 胞形态更致密、均一，呈现典型的铺路石状，具有接触抑制性，当撤除ESC—CM 后，处理组细胞失去已获得的增殖能力，细胞传代不能超过5代。实验组Pl和 显著增加。实验组细胞粘附能力强，贴壁细胞死亡率低；先于对照组进入对数生 长期，细胞倍增时间短；克隆形成能力更强，形成的克隆大，细胞数量多；表达 角膜上皮细胞标记物，核型正常，不致瘤。经过ESC．CM处理的兔角膜上皮细 胞在气一液界面刺激下可以形成复层上皮结构，其表面具有丰富的微绒毛，角膜 beta 上皮特异性标记物CK3／CKl2、细胞连接Desmocollin 3、Occludin、Integdn 巾III大学博Ij后出站报告 胚胎下细胞条什培养液促进兔角膜I：皮细胞长期增雅的实验研究 4和摹底膜成分tV Collagen均呈阳性表达：p63和ABCG2呈阴性表达。 结论 本研究成功建立了一种安全、高效、可控的胚胎干细胞微环境培养体系，该 体系能够为角膜上皮的增殖提供保护作用，延缓细胞衰老，经过处理的角膜上皮 细胞具有复层形成能力和初步的屏障功能，该技术能够为再生医学研究提供充足 的低免疫原性的自体种子细胞。 关键词：胚胎干细胞微环境，角膜上皮细胞，增殖，衰老 ¨I l}|llJ大学