抗人脑胶质瘤单克隆抗体SU2000的建立及其识别抗原的提取.pdfVIP

抗人脑胶质瘤单克隆杭体SU-2000的建立及其识别杭原的提取 中文摘要 抗人脑胶质瘤单克隆抗体 SU-2000的建立及其识别抗原的提取 (摘要) 晒言胶质瘤单抗是””‘’年Schegg率先研制成功的·由于血脑屏障的 存在，鼠源性单抗对人体而言是异种蛋白，分子量大，临床应用中受到 一定的限制。为此小分子人f七的抗胶质瘤单抗随着分子生物学的深入 发展应运而生，但在临床上得.U应用的极为少见，原因在于其特异性差、 活性低。鼠源性杂交瘤单抗则q‘其效价高，特异性好的优势，临床应用 的势头未减，建立杂交瘤细胞株仍然是获取单抗的主要手段。本实验在 当年建立SZ38.SZ39方法的基础上，进行适当改进，旨在建立一株新型、 具有高效、高特异性、高产的杂交瘤细胞株。 、 1.SU-200。杂交瘤细胞株的建立少 目的:制备新的分泌抗人脑胶质瘤单克隆抗体的杂交瘤细胞株。/ 沛 · 法 ①利用SHG-44胶质瘤细胞作为抗原免疫BALB/c小鼠，取脾细胞和SP2/0 骨髓瘤细胞融合，通过1-IAT选择性培养，使目的细胞增殖并形成克隆; ②分别利用SHG-44细胞、正常脑组织的总蛋白作为阳性、阴性抗原包板， 行ELISA检测，筛选出阳性孔;③对阳性孔进行单克隆化，证实杂交瘤 细胞100%分泌单抗后，予冻存、保种;④小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，获 取含单抗的腹水;⑤半年后按常规方法复苏杂交瘤细胞。结果:①HAT选 择性培养后，有26孔出现杂交瘤生长;②ELISA检测，筛选出一个阳性 孔;③经过多次单克隆，杂交瘤细胞 100%分泌单抗;④小鼠腹腔注射杂 交瘤细胞后，获得含大量单抗的腹水;⑤半年后，复苏杂交瘤细胞5次， 均获成功)结论:初步建立起一株分泌抗人月。胶质瘤单克隆抗体的杂交 抗人脑胶质瘤单克隆杭休SU-2000的建立及其识别抗原的提取 中文摘要 瘤细胞株，命名为SU-2000(苏大一2000年)。 2.SU-2000单抗的鉴定 目的:对SU-2000单抗的重要特征进行鉴定，为进一步的应用提供依据。 防 法 ①亚类鉴定:抗小鼠IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3重链单抗作为分 型 抗、 体 采用双向免疫扩散法进行亚类分析;②效价测定:SHG-44胶质 瘤细胞作为抗原包板，分别将腹水及纯化单抗进行倍比稀释，通过ELISA 检测鉴定腹水效价及抗原抗体的结合力;③组织特异性分析:肿瘤及正 常人体组织标本制成石蜡切片，细胞制成悬液涂在玻片上，冷丙酮固定， 纯化的SU-2000单抗作为一抗进行免疫组化染色。④单抗识别抗原的定 位:SHG-44细胞培养在玻片上，冷丙酮固定，纯化的SU-2000单抗作为 一抗，分别行免疫荧光和免疫组化染色。结果:OOSU-2000单抗和抗IgG1 之间出现了沉淀线;②腹水经1:204800稀释后仍能和SHG-44胶质瘤细 胞起反应，1.33mg/ml的单抗经1:102400稀释后仍能和SHG-44细胞起 反应;③SU-2000单抗和8例星形胶质瘤均起阳性反应;和4例脑膜瘤、 2例脑转移癌呈阴性反应;与颅外肿瘤的反应中，除黑色素瘤外，均呈阴 性反应;和16种人体正常组织无一出现阳性反应;④免疫荧光及免疫组 化染色表明，SHG-44胶质瘤细胞上以胞膜染色为主，胞浆可能也有染色。夕 结论:SU-2000单抗属IgGI亚类，识别的抗原主要位于胞膜，达到了效 价高、特异性好的质量标准。 3.SU-2000识别抗原的提取 目的:提取SU-2000识别的抗原，为胶质瘤疫苗的制备创造条件。 将纯化的SU-2000单抗和BrCN-Sepharose-4B偶联制成层析柱，将 SHG-44细胞获得的总蛋白加入层析柱，在恒流泵的推动下循环过柱 小时后将结合的抗原洗脱、提取。结果:ELISA检测表明:提取的抗原 杭人脑胶质瘤单克隆抗体SU-2000的建立及其识别抗原的提取 中文摘要 和SU-2000单抗呈强阳性反应;SDS电泳、Westernblot表明:抗 原提取液所在的泳道75KI〕处出现了清晰条带:提取的抗原和SU-2000 单抗呈阳性反应月结论:SU-