抗人血小板第4因子单克隆抗体SZ95的研制及其应用研究.pdfVIP

抗人血小板第4因子单克隆抗体 (SZ-95)的研制和应用研究 内容 提 要 内容 提 要 抗人血小板第4因子单克隆抗体 (SZ-95) 的研制及其应用研究 由于血小板第4因子 (PF4)分子量低，结构中保守区域多，使 得用传统免疫方法制备抗人PF4单克隆抗体比较困难。本实验室用 微量的人PF4，以脾内免疫结合常规免疫的方法使小鼠脾细胞产生足 够的免疫反应，经细胞融合和筛选后，得到了一株稳定的高效价的 IgGl亚类的抗人PF4单克隆抗体，命名为SZ-95。抗体的鉴定表明 SZ-95特异性结合正常人血小板中PF4，不识别包含PF4分子中间大 部分氨基酸序列的合成多肤 (P34-58)，以及与PF4高度同源的0一血 小板球蛋白(0-TG)。因此我们用自备的SZ-95IgG-Sepharose4B 亲和层析柱，直接从血小板破碎液中纯化到了具有生物活性的高纯度 PF4。同时，以纯化的PF4制备了抗人PF4多克隆抗体，将其与单抗 SZ-95一起进行肝素一PF4复合物ELISA，其结果显示抗体结合复合物 的量呈肝素依赖性改变，而 SZ-95识别抗原受肝素与PF4结合的影 造血和血管新生 嗬。朴-95将是深入研究PF4调控血栓形成和止血、 的分子机制和临床评价血小板活化状态的有效的工具。 关键词:血小板第 4因子;单克隆抗体;肝素;0一血小板球蛋白; 亲和层析 抗人血小板第4因子单克隆抗体 (SZ-95)的研制和应用研究 论 文 摘 要 论 文 摘 要 抗人血小板第4因子单克隆抗体 (SZ-95) 的研制及其应用研究 血小板第4因子 (PF4)是一类与细胞粘附、迁移、活化、扩增、 造血及血管形成等有关的趋化因子家族的一员，与p一血小板球蛋白 (0-TG)，白细胞介素8(1L-8)，中性粒细胞激活蛋白2(NAP-2) 等具有N一端相同的CXC保守序列。在生理状态下，PF4以四聚体为 主储存在人类血小板a颗粒内，活化后从血小板释放，容易与血浆或 细胞表面的糖胺聚糖(如肝素或内皮细胞表面的硫酸乙酞肝素)结合。 人类PF4单链有70AA，分子量为7767Da,N端的CXC中的C10和 C12分别与C36和C52形成二硫键，分子中部是三个反平行的0折 叠，C端的。螺旋被认为是与肝素结合的主要区域。近期研究表明， PF4不仅是临床上重要的血小板活化标志物，而且具有保护造血干细 胞，抑制新生血管形成的生物学活性，显示在肿瘤和血管性疾病的治 疗方面具有可观的临床应用前景，有可能成为一种有效的抗血管形成 和放化疗保护药物。因此我们希望通过制备抗人的PF4单克隆抗体 来研究PF4调控血栓形成和出血，造血和抗血管形成的分子机制， 并可为临床诊断和评价血栓相关性疾病提供灵敏和有效的检测方法。 由于人类PF4的分子量低，结构中保守区域多，使得许多用传 统免疫方法制备抗人PF4单克隆抗体的尝试都没有成功。本实验室 在用常规方法初次免疫后，以脾内直接注射法进行冲击免疫，只用微 量的人PF4就使Babl/。小鼠的脾细胞在短时间内产生免疫反应，经 细胞融合和ELISA筛选后，成功地得到了一株稳定的高效价的IgG1 抗人血小板第4因子单克隆抗体 (SZ-95)的研制和应用研究 论文摘要 亚类的抗人PF4单克隆抗体，命名为SZ-95oWesternblot的结果显 示SZ-95与血小板破碎液中分子量与人PF4纯品一致的蛋白区域结 合，说明了其识别人PF4的高度特异性。间接ELISA及点杂交表明， SZ-95不识别与PF4高度同源的血小板特异性蛋白:5一血小板球蛋白 (0-TG).SZ-95也不识别PF4第34位到第58位的合成多肤 (P34- 58)，而这段多肤被认为包括了一个非肝素依赖性的却有更强抑制造 血和血管新生活性的 “新”功能区，提示我们SZ-95识别的抗原表位 可能就位于在PF4N末端的可变区