外文翻译-关于柑橘青果病的两种韧皮部杆菌的PCR检测.doc

本科毕业论文(设计) 外文翻译 题 目 关于柑橘青果病的两种韧皮部杆菌的PCR检测 姓 名 程旭云 学 号 20040301028 专 业 动植物检疫 指导教师 丁芳 职 称 讲师 中国·武汉 二○○八年五月  关于柑橘青果病的两种韧皮部杆菌的PCR检测 原文来源：Sandrine Jagoueix,Joseph Maric Bove,Monique Garnier.PCR detection of two‘Candidatus’liberobacter species associated with greeing disease of citrus.Molecular and Cellular Probes,1996,10:43～50 国家农业研究院留尼旺岛马达加斯加留尼旺岛 实际上，抽提DNA进行圆点印迹法能让我们在很短时间内迅速的进入下一步骤。PCR是一种简单、快捷和灵敏的方法，的确如此，我们把它作为早期DNA克隆的目的，得到亚洲菌系和非洲菌系的16SrDNA的基因序列。通过基因序列比较分析，模板和扩增的韧皮部杆菌的核糖体DNA有明显的相同部分。在这篇论文里，我们研究最初细菌的特异性，必须要求扩增从柑橘叶片中抽提的韧皮部杆菌属的rDNA。上面的扩增片段中，可以用扩增DNA的限制性内切酶来区分不同的韧皮部杆菌的种类。 1.材料和方法 1.1植物材料 长春花（蔷薇属）和甜橙（柑橘科），均受到亚洲菌系和非洲菌系的两种不同病菌的感染，并体现初出早期的症状。这两类植物，其中感染亚洲菌系的主要放置在白天30℃和晚上25℃的温室中；感染非洲菌系的放置在白天25℃和晚上20℃的温室中；另外健康的长春花和柑橘植物通过播种，在25/ 20℃的温室里生长获得。 1.2提取植物中的DNA 使用默里和汤普生提出的常规CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法来抽提DNA。 提取柑橘叶片研磨液，准备PCR。 1.2.1方法1： 取0.5g的叶片中脉，用刀片切成细小的碎片放在一个碟状的可使用的研钵中，加入1ml的0.3M NaCl。研磨成浆液状态，用注射器收集进行100g的低速离心时，进行离心。PCR既可以直接在10折至100折的稀释的悬浮液上完成，也可以在悬浮液以16000g离心5min后形成的沉淀物和用100ul灭菌水的稀释液上进行。 1.2.2方法2： 取叶片中脉（大约0.1g至 0.3g），用刀片切成细小的碎片放在一个碟状的可使用的研钵中，加入1ml的TE缓冲液（10mM Tris PH 8.0,400 mM EDTA,1%SDS）Fd1和rP1被用作常规的原核生物16SrDNA的扩增；引物OI2c和OI1，用为亚洲菌系（印度浦那品种）16SrDNA的扩增；引物OA1用作非洲菌系（南非的内尔斯普雷特品种）的16SrDNA的扩增，引物OI1同样可以用作扩增非洲菌系，除了有三个基本的变化。因而它们用来作韧皮部杆菌的16sDNA的特异性扩增。PCR反应是在50ul的混合溶液中进行的，其中含有0.5μM的底物、200μM的三磷酸脱氧腺苷、78mM的Tris-HCL（PH 8.8）(NH4)2SO4、10 mM β-巯基乙醇、0.05% W1去垢剂、200μg/mlBSA（Gibco公司生产）还有2.5U的Taq聚合酶（Gibco公司生产）。温度循环器fD1/rP1为引物；92℃ 40s（变性）和72℃ 90s（退火和延伸），循环35次，以OI2c/OI1, OI2c/OA1 或者OI2c/OI1/OA1 为引物。扩增反应结束后，用8μL反应混合液在0.7%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。 限制性内切酶分析扩增DNA片段 在最后，用35μL的量（根据制造厂商而定）20U的Xba1 限制性内切酶来切割8μL扩增DNA片段，静置时间为一晚上。这种切割的DNA片段通过4%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。 3.样品回收 在越南和毛里求斯岛的不同的果园里采集带有青果病症状的或不带有症状的柑橘叶片，把这些样品用塑料袋装好，放入通气的箱子中，然后放在冰箱中处理或由邮件寄给波尔多市（交货时间一般为48-72h）。一些越南的样品被送到法国时已经过了10天。在到达实验室之前，叶脉是分离开的；按2g的叶脉分批在-80℃冷冻保存，以备以后提取DNA和圆点印迹杂