氨基酸的分离鉴定—纸层析法2011.11.pptVIP

氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、实验目的 掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待测样品的氨基酸成分。 二、实验原理 纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。 溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示： Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、实验器材 （1）大烧杯（5000mL）：1只/组 （2）培养皿：1只/组。 （5）层析滤纸（长20cm、宽12cm的 滤纸）：1张/组。 （6）直尺、铅笔 （7）电吹风：1只/组。 （8）托盘、双面胶：1套/组。 （9）手套：1双/组。 （10）塑料薄膜：公用。 （11）量筒：50mL，1只/组。 四、实验试剂 （1）扩展剂： 将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中，与3体积水混合，倒入分液漏斗充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。再按0.1%浓度的比例加入质量相当的茚三酮。 （2）氨基酸溶液： 1、0.25%蛋氨酸标准溶液：精确称取0.125g 蛋氨酸， 溶于50mL 蒸馏中，摇匀、充分溶解。 2、0.25%组氨酸标准溶液：精确称取0.125g 蛋氨酸，溶于50mL蒸馏水中，摇匀、充分溶解。 3、 0.25%待测溶液：精确称取0.125g 待测样品， 溶于50mL 蒸馏中，摇匀、充分溶解。 实验试剂 五、实验操作 检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。 （1）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯内，用塑料薄膜密封起来，平衡20min。 （2）规划：带上手套，取宽约12cm、高约20cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做3个记号（×） ，记号之间间隔3cm，这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位），参见左图。 （3）点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在中间3个记号（×）上，风干后再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm。每人须点3个样，其中2个是已知样，1个是待测样品。 （4）层析：用双面胶将滤纸粘成筒状，点样面向外，纸的两侧边缘不能接触且要保持平行，参见图3-3。向培养皿中加入扩展剂，使其液面高度达到1cm左右，将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面在A线下约1cm），罩上大烧杯，仍用塑料薄膜密封。当展开剂上升到8～10cm，取出滤纸，剪断双面胶连线，立即用电吹风热风吹干。 （5）显色：用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后立即用热风吹干，即可显出各层析斑点，参见左图。 （6）计算各种氨基酸的Rf值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表3-2。 （7）以层析时间为横坐标，扩展剂上升高度为纵坐标画图，求出扩展剂上升到18cm时所需要的时间。 （8）将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净，倒掉用过的展层液和平衡液，将培养皿洗净，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。 计算：Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到 溶剂前沿的距离 ? 纸层析结果 * *