PRRSV+GP5基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立.pdfVIP

lIIIlIIIIIlUlI IItMIIIIIIIIqIltlIlIll} Y2143117 摘要 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine and reproductiverespiratory 由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine and virus。 reproductiverespiratorysyndrome PRRSV)引起的～种高度接触性传染病，该病可导致母猪的繁殖障碍以及仔猪严重 的呼吸道疾病和高死亡率。建立快捷的诊断方法，采取相应的控制措施，是预防该病 的有效手段之一。本研究以dGP5重组蛋自为包被抗原，建立一种快速简便的血清学 方法。 从六份疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的瘸猪肺脏中，扩增GP5蛋自完整的基因 GP5 片段，将其克隆至pMDl8．T载体进行测序、PCR及酶切鉴定。鉴定结果表明， 基因片段大小为600 bp，且与其它毒株的同源性为99％。GP5蛋白在表达系统中难以 表达，所以本研究去掉了氨基端疏水性较强信号肽序列。根据pMDl8．T克隆载体以 5．0软件设计另一对特异性引物，从重组载 及pGEX一6p。1表达载体的特点，用Primer mmol／L BL21感受态细胞中。经l 为40ku的蛋白，与预期的融合蛋白分子量基本一致，以包含体形式表达。又经 分子质量40l(u的摄自即为目的蛋白。将纯化的重组蛋白免疫BALB／c小鼠，制备血 清。虽然病毒中和试验显示该抗体并没有中和活性，该血清却能够与重组蛋酝产生特 异性反应。 利用纯化的融合蛋白作为包被抗原，通过优化工作条件，建立了检测PRRSV抗 体的间接ELISA方法，该方法的最适反应条件为，抗原最佳包被浓度为1．25 1-tg／mL， h，4℃过夜。血清最佳 封闭液为含5％犊牛血清的PBST，封闭时间是37℃封闭2 h， h，酶标抗体1：400稀释，37℃作用1 稀释度为1：80，待检皿清37℃作用1 底物显色15 敏感性为90。3％，符合率88％。丽且该方法还具有价格低廉、简便、快速等优势。 性试验结果显示，变异系数均值都小于10％，表明本方法具有较好的特异性和重复 性。 本研究为免疫猪群的PRRSV抗体检测及其流行病学调查提供了一种快速、简便 的血清学诊断方法。 融合强自 关键词：PRRSV；GP5基因；克隆；原核表达； ofGP5GeneofPRRSVand Prokaryotic AnIndirectELISA Expression，Subcloning fortheDetectionofViralAntibodieswiththe Produce Expr