瞬态荧光光谱仪在核壳纳米体系中能量传递过程中的应用经验.docVIP

瞬态荧光光谱仪在核壳纳米体系中能量传递过程中的应用经验 　　摘 要：本文构建了一种以核壳纳米颗粒为模型的体系，研究在荧光团激发后的能量传递过程。其中，以15nm大小的金纳米颗粒作为核，在金纳米核周围包裹一层13nm厚度的二氧化硅壳层作为间隔，在壳层外侧以共价键的形式修饰一层FITC染料分子，利用瞬态荧光光谱仪清晰地判断出了其中的辐射跃迁以及非辐射跃迁速率，从实验结果看出，染料分子发生能量传递之后，其辐射跃迁速率升高，非辐射跃迁速率降低。 　　关键词：瞬态荧光光谱；能量传递；辐射跃迁速率；非辐射跃迁速率 　　分子吸收能量使得基态的电子被激发到单线激发态，并由第一单线激发态回到基态时发出的光就是荧光。荧光寿命是指分子在单线激发态所平均停留的时间，即激发态的电子回到基态所用时间，这个速率一般为108s-1，因此一个典型的荧光寿命大致为10ns。由于荧光寿命所处的时间范围是一个非常短的时间，因此检测荧光寿命需要非常精密准确的光电仪器，通常所用的荧光寿命的仪器为瞬态荧光光谱。荧光团的荧光寿命不但与其自身的结构关系密切而且与其所处微环境的极性、粘度等条件有关，研究体系所发生的变化，都可以通过荧光寿命测定得到直观的了解。例如，分子之间发生的团簇、荧光团与荧光受体之间发生共振能量传递、两个分子或者荧光团由于光诱导下发生的电荷传递导致荧光的猝灭以及蛋白质结构大重排异构等现象都能通过荧光寿命的表征“看”出究竟[1]。 　　与稳态荧光光谱相比，瞬态荧光光谱有着其他一些无法比拟的优势[2]，例如，稳态荧光中，荧光的强度变化与物质的浓度有着绝对的依赖关系，一般的检测利用这一关系能够方便的对物质的性质，体系的变化过程有一个大致的认识，但是有时这种过于依赖浓度却容易成为测试过程中的误差及人为操作失误。与稳态荧光光谱法相比，荧光寿命的测量则与荧光体周围环境的散射和光学系统的调整无关，且不依赖于从荧光团到探测器的光学路径，因而，在很多情况下是一种更有效的检测方法[3]。例如，在研究荧光共振能量传递过程中的机理时，由于发生了能量传递，从稳态光谱中可以观测到荧光强度的猝灭或升高，依据这一现象可以解释供体及受体之间所发生的传递机理，但是稳态光谱中的荧光信号强度与浓度的关系密切，但是在实验操作的过程中有时由于实验的需要，对体系进行其它处理（例如，离心、稀释等）。这就导致观测到的荧光信号不是由于能量传递过程导致的而是因为一些操作误差所引起。而通过瞬态荧光光谱进行荧光寿命的测试就能很好的规避这些现象，因为，荧光寿命的变化只能由于发生了共振能量传递，使得供体受体荧光发射机理了变化。因此，在研究荧光发射机理等实验中，瞬态荧光光对于稳态荧光是一种很好地补充及佐证[4]。本文将重点介绍瞬态荧光光谱的测试手段、机理并且以德国PicoQuant公司的荧光光谱仪为例，介绍在科研工作中的实际操作及应用过程。 　　1.荧光寿命的测定 　　现代方法中荧光寿命的测定主要包括三种：时间相关单光子记数法（Time 2 Correlated Single 2Photon Counting ， TCSPC ）、相调制法（ Phase Modulation Methods） 和频闪技术（ Strobe Techniques）[3] 　　1.1相调制技术 　　相调制技术也称之为“频域法”（Frequency 2 Domain Method）。正弦调制的激发光激发样品后，发射光与激发光之间存在着一种受迫响应，因此发射光和激发光有着相同的圆频率（ω），但是由于荧光寿命的存在，电子在激发态会有一定的停留时间，调制发射波在相上滞后激发波一个相角。利用实验测定的相角和解调参数，可计算出相寿命（τp）和调制寿命（τm），对于单指数衰减，τp与τm相等。 　　1.2频闪技术 　　频闪技术也叫脉冲取样技术（Pulse Sampling Techniques），测定中，样品被脉冲光源激发。与脉冲光源同步，电压脉冲启动或按一定程式延迟启动光电倍增管，光电倍增管按预设时间门检测样品的荧光强度。一般检测时间门比荧光寿命短得多，这样通过逐渐改变光电倍增管的延迟时间，可以得到样品被脉冲光源激发后不同时刻的一系列荧光强度。 　　1.3时间相关单光子记数法 　　TCSPC是目前主要应用的荧光寿命测定技术，简单的说单光子计数法的工作原理是：光源发出两束相同的脉冲光，其中一束通过起始光电倍增管，使得光电倍增管产生一个电信号，该信号启动时辐转换器开始工作，另外一束脉冲光到达样品池后，激发样品，产生的荧光通过单色器等到达终止光电倍增管，终止光电倍增管产生的信号停止时幅转换器的工作，而这样的一个时间差被多道多道分析仪 （ Multichannel Analyzer）进行记录、累计，表明产生了一个该时间下的光子，经过几十万次