粒细胞集落刺激因子治疗急性肝衰竭实验研究.pdf

摘要 背景急性肝衰竭是由病毒、药物、免疫、代谢等多种因素引起 的肝细胞大量坏死而导致的严重的I临床综合征。在我国引起急性肝衰 竭的首要原因是病毒，即临床所见的重型肝炎。尽管临床大多数患者 被诊断为慢性重型肝炎，实际上大部分患者的临床经过都是在慢性肝 病基础上发生的急性肝衰竭。由于缺乏有效的内科治疗手段，目前病 毒性肝炎所致急性肝衰竭的病死率仍高达50．80％。肝衰竭能否逆转 主要取决于受损肝细胞的坏死程度和残余肝细胞的再生能力，因此从 阻断肝细胞坏死和促进肝细胞再生这两方面探讨和尝试新的治疗措 施有重要意义。研究发现生物学效应广泛的造血生长因子一粒细胞集 落刺激因子(G．CSF)具有免疫调节的作用，具体表现在G．CSF能 够改变机体在脂多糖(LPS)刺激后释放促炎性和抑炎性细胞因子的 平衡。而肠源性内毒素血症在病毒性肝炎急性肝衰竭的发病机制中起 重要作用，LPS激活枯否细胞释放细胞因子和炎性介质，在原发性损 伤的基础上，加重肝脏的损伤。推测G．CSF可以通过改变单核巨噬 系统在LPS作用下的细胞因子的释放平衡阻断急性肝衰竭的发生发 展，对急性肝衰竭具有保护作用。另一方面，随着干细胞研究的深入， 观察到骨髓造血干细胞有增殖分化为肝细胞的潜能。在肝细胞大量破 坏且增殖受到抑制的情况下，造血干细胞可迁移入肝脏，参加肝脏结 构和功能的重建。G．CSF正是造血干细胞的有效动员剂，因此推测 G—CSF可通过动员造血干细胞促进肝脏损伤后的肝细胞再生。 目的体外观察G．CSF对慢性重型肝炎(急性肝衰竭)患者外 周血单个核细胞(PBMC)功能的调节作用，并在此基础上将G．CSF 用于治疗D．氨基半乳糖(D．GalN)和LPS联合所致的小鼠急性肝衰 竭模型，探讨其可能的作用机制，为临床治疗急性肝衰竭提供新的思 路。 方法 (1)分别收集慢性重型肝炎患者和健康志愿者的外周静脉血， 单独刺激组。体外培养48小时后分别用放射免疫法和酶标记免疫吸 附测定法检测各组培养上清中的TNF．Ⅱ、IL．6、IFN吖和L．10水平； mRNA表达水平。 (2)D-GaIN 1099／kg腹腔注射制造小鼠急 600mg／Kg联合LPS 性肝衰竭模型：治疗组于造模前24小时，2小时和造模同时分别给 予rhG．CSF 300“g／kg腹腔注射，对照组相应予生理盐水腹腔注射， 比较两组小鼠24小时存活率、血清转氨酶及肝组织病变程度，并用 RT-PCR法检测肝组织中的TNF．Ⅱ、IL．6、IFN．1，和L．10mRNA表 达水平，采用原位末端标记法检测肝细胞凋亡。 (3)D—GaIN 600mg／Kg联合LPS1099／kg腹腔注射制造小鼠急 性肝衰竭模型。G．CSF动员组于造模前72小时、48小时，24小时 300 分别给予rhG．CSF pg／kg腹腔注射，对照组相应予生理盐水腹腔 注射。5．溴脱氧尿核苷(Brdu)标记法检测肝细胞的增殖指数；免疫 组化法检测肝内的干细胞标志Thy．1以明确造血干细胞的迁入情况； 平。 的增殖曲线和BrdU标记指数。 结果 1．慢性重型肝炎(急性肝衰竭)患者和健康志愿的PBMC在体 明显高于空白对照组，而经G．CSF预培养的PBMC上清中的TNF．Ⅱ 1， IL·10水平 的mRNA水平变化与培养上清相同。 II 2．D．GalN／LPS所致的小鼠急性肝衰竭，24小时存活率为20％， 组织学可见大面积肝坏死，血清转氨酶明显增高，肝细胞大量凋亡。 与对照组相比，治疗组小鼠的24小时存活率显著提高(68％vs20％。P IFN-7 0．796vsl．046，P0．001)，IL一6和IL．10mRNA水平则显著高于对照组 (1．509vs0．912，P=0．007；0．996vs0．811，P=0．012)。 3．G．CSF预处理组小鼠肝