hTERT启动子调控腺病毒介导HSV-TK%2fGCV基因系统治疗膀胱癌实验研究.pdfVIP

.…“_二少文M4-*一一一一一一一一一一 hTERT启动子调控膝病毒介导的HSV-TK/GCV基因系 统治疗膀肤痛的实脸研究 摘 要 目的:膀胧肿瘤是泌尿系最常见的肿瘤。治疗膀耽肿瘤 目前有多种方法，在过去的几年中基因治疗膀耽瘤己经成为 了重要的研究重点之一。分子化学治疗又称自杀基因治疗， 他是将编码某些特定酶的基因导入肿痛细胞，这些酶可将无 活性或低毒的药物前体转化为具有较强细胞毒性的药物，从 而杀死肿瘤细胞。单纯疤疹病毒脚普激酶基因(herpes simplexvirusthymidinekinase，HSV-TK)/丙氧鸟昔 (ganciclovir,GCV)系统是分子化疗中研究最为深入的一 种。HSV-TK酶可将GCV磷酸化为GCV-磷酸，继而在哺乳动 物细胞TK酶的催化下最终转变为GCV三磷酸，抑制DNA聚 合酶的活性，掺入DNA合成，产生细胞毒性。而且研究发现 该方法还具有 “旁现者效应”，即转染细胞可以杀死附近未 转染细胞的特性，从而弥补转染效率低的缺陷，发挥更强大 的治疗作用。在分子化学治疗中，要实现选择性地消除肿瘤 细胞，必须将基因的表达限定于肿瘤细胞，即实现肿瘤基因 治疗的靶向性。肿瘤基因治疗中为了获得肿瘤特异靶向性， 可以使用特异性启动子在转录水平控制目的基因的表达水 平。近年来人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereverse transcriptasehTERT)基因的启动子已被证实在9096以上的 人类肿瘤组织中活性上调，现在成为肿瘤基因治疗中转录靶 向的研 究热点 。病毒介导 的酶解前体药疗法 中文 摘 要 (virus-directedenzymeprodrugtherapy,VDEPT)因其 转染率高，毒副作用小的特性近年来已成为肿瘤基因治疗研 究中的一个热点。重组腺病毒为一良好的转基因载体，没有 致病性，为DNA病毒，不发生插入突变，载体操作方便，宿 主广泛，容易增殖，携带外源基因容量大，可以表达接近翻 译后成熟水平的蛋白质。探讨腺病毒介导单纯疙疹病毒胸昔 激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase,HSV-TK) 基因/丙氧鸟普(GCV,ganciclovir)自杀基因系统对膀耽癌 细胞(253J)的杀伤作用。 方法:利用携带增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreen fluorescentprotein，EGFP)基因的重组病毒感染膀耽癌 细胞 (253J)、成纤维细胞 (MRC-5)，荧光显微镜下观察 感染效率;利用携带HSV-tk和人端粒酶逆转录酶启动子 (humantelomerasereversetranscriptasegenepromoter, hTERTp)基因的腺病毒载体 (Ad-hTERTp-HSV/tk)以及携带 HSV-tk和小鼠巨细胞病毒启动子 (mousecytomegalovirus promoters,CMV)基因的腺病毒载体 (Ad-CMV-HSV/tk)感染 253)和MRC-5，进行体外GCV敏感性试验，按每孔5X10 个细胞的密度接种细胞于96孔板，一式三份，次日加入不 同MOI(0,1,10,100,1000)的病毒系列稀释溶液。感染 24小时后加入不同浓度(0,1,10,100,1000umol/L)的 GCV(ganciclovir)溶液，继续培养36h，以GCV处理孔与非 处理孔的存活细胞数比值表示细胞生存率(mean士SD)eMTT 法评估不同浓度GCY对253J细胞的杀伤作用。将含不同浓 度的膀耽癌TK细胞与膀脱癌无TK细胞混合培养，分别用丙 氧鸟昔 100umol/L进行处理，观察细胞形态改变、测定活 一 2 中丈 摘 要 细胞数并行MTT法测定存活率。 结果:携带报告基因的重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP转染 细胞后在荧光显微镜下观察，发现在膀脱癌细胞中有荧光出 现，而在人正常细胞中则无荧光.而重组腺病毒Ad-CMV-EGFP 转染细胞后则在二种细胞株中都可以观察到绿色荧光出现。