5.第五章扫描电镜样品的制备.pptVIP

* 第五章 扫描电镜生物样品制备技术 常规电镜样品要求： 必须是干燥的，不含水分或可挥发性物质； 具有一定机械强度，能耐受电子束轰击； 具有导电性，被激发时能够产生足够的二次电子。 生物材料特点：含水分多，质地柔软，机械强度小； 组成元素的原子序数低，导电性差， 激发后二次电子的产额较少。 制样的任务： 通过一系列处理，既要尽量完美地保存材料的固有形态， 又要改良其物理性能，使其适合在电镜下观察成像。 主要内容：第一节 SEM样品的常规制备技术 第二节 特殊要求的扫描制样技术 第一节 扫描电镜样品的常规制备技术 冷冻 断裂 粘样或滴样 熏蒸固定 干燥 花粉、种子及孢子类样品 管道铸型 腔形器官 取材 清 洗 固 定 脱水 干燥 粘样 镀膜 镜检 清洗 菌类和组培细胞 取材 清洗 固定 脱水 干燥 粘样 镀膜 镜检 一、取材 即：获取观察材料。 遵循五字原则：准、轻、小、净、浓 1.迅速准确： 取材动作要快，部位要准确。 方法：因材料而异，通过破碎、解剖、切割、 分离、提纯等手段，获取样品最佳观察面。 2.动作轻巧：保护好拟观察面。 解剖器械要锋利，不能对材料施加锯、挤、拉压 的外力。含水分多的、幼嫩材料最好冷冻断裂法。 3.厚度小： 满足观察条件的最小体积，厚度为1~2毫米 4.纯净防混杂： 花粉、孢子类样品注意防尘、防混杂 5.悬浮液样品要求合适的浓度： 浓度太大造成样品堆积；浓度小则检出困难。 取材 清洗 固定 脱水 干燥 粘样 镀膜 镜检 二清洗：确保得到清洁的观察表面 1.完整的制样程序中有三次清洗 固定前清洗：洗去表面的灰尘、黏液等附着物， 确保获得清洁的观察表面。 前固定后清洗：洗净醛类固定液，以免戊二醛与锇酸 反应而削弱锇酸的固定效果。 脱水前的清洗：洗净固定液，以免固定液与脱水剂 反应而产生沉淀，影响观察效果。 2.清洗液的类型与选择：蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等 选择原则：清洗液的pH值、渗透压、温度应该尽量接近样品的生理值，以免样品因环境突变而导致形态变化。 植物材料：蒸馏水洗净尘埃； 动物材料：等渗生理盐水、5%碳酸钠或缓冲液洗去黏液等； 游离细胞：用等渗的缓冲液清洗(精子、血细胞、微生物)； 覆盖大量黏液的样品(胃黏膜)用低浓度的蛋白水解酶溶液洗； 组织培养细胞：用相应的培养液清洗； 特殊样品：如乳腺组织富含蛋白质和脂类，分别用16%的 甘油和20%乙醇浸泡清洗； 表面附着蜡质、角质层的样品：用有机溶剂脱蜡。 选择方法： 取材 清洗 固定 脱水 干燥 粘样 镀膜 镜检 取材 清洗 固定 脱水 干燥 粘样 镀膜 镜检 3.清洗方法： 不同材料采用不同方法，灵活应用 （1）植物材料：根部用水冲洗去泥土，植株用水冲洗或滴洗。 观察气孔状态时应注意清洗后取材时机。 （2）较干净的样品：固定后20倍体积的清洗液轻摇，换液三次。 （3）表面附着大量黏液的样品：振荡法或喷射瓶壁加压冲洗。 （4）游离细胞、微生物：离心法清洗。 （5）超声波清洗：用于表面结构复杂、凹陷、皱折多的样品。 样品置清洗液中，超声波清洗器内清洗，必须控制功率 （6）灌流清洗：观察管腔内壁结构的样品，避免血液、 组织液凝聚而影响观察效果。 通过动脉注入清洗液，直到排出液变清为止。必须控制压力 清洗液与样品混合摇匀 低速离心（反复三次） 取材 清洗 固定 脱水 干燥 粘样 镀膜 镜检 1.单固定：只用一种固定剂（通常戊二醛）固定的方法。 2.熏蒸固定：固体培养基上培养的菌丝类样品， 用锇酸（或甲醛）蒸汽熏蒸固定0.5~1小时。 3.双固定： 戊二醛(1~3h)—锇酸(0.5~1h) 4.冷冻固定：液氮超低温快速冷冻可保存样品的生活状态。 5.不固定：干种子、花粉、孢子类、毛发类样品。 四、脱水：梯度系列脱水法。 注意：根据材料性质和大小而调节脱水时间。 三、固定方法 取材 清洗 固定 脱水 干燥 粘样 镀膜 镜检 五、干燥： 指除去样品中的残存液体（水或脱水剂）， 使样品中不含液态物质的过程。 原因：液态物质脱离样品表面时必须克服表面张力， 其反作用力会使样品表面结构产生形变。 1.自然干燥法：样品中的水分或脱水剂在大气中自然蒸发使样品干燥。 适宜样品：花粉、孢子、种子、果壳、木质纤维、骨骼； 游离细胞类在脱水