实验二叶绿体的分离与荧光观察.pptVIP

实验二 叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的： 1 ．了解叶绿体等细胞器分离的一般原理和方法 2． 熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光。 二、原理 差速离心是分离细胞器的一般方法。通过离心力和时间的增加，可将不同的组分分批次沉降，从而分离出各种亚细胞组分。 叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。 某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。 三、材料和试剂 1． 新鲜菠菜 2． 0.35mol/L NaCl、0.01%吖啶橙 四、操作步骤 1． 将新鲜菠菜叶洗净擦干后，加入少量0.35 mol/L NaCl匀浆，并悬浮于0.35 mol/L NaCl中；每组4-5g叶片，共30ml生理盐水。 2．4-6层纱布过滤，滤液1000rpm离心2min，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，取上清液再在3000 rpm离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）； 3．弃去上清液，用约0.5-1ml 0.35mol/L NaCl悬浮沉淀。 在室温下进行分离要迅速。 4．观察：取悬液直接滴片观察； 5．叶片斜向切面（或手斯叶面下表皮）观察； 6．再分别用吖啶橙染色观察。 五、结果和讨论 1． 叶绿体自发荧光和激发的次生荧光在显微镜下有何不同？ 2． 匀浆时间与叶绿体悬液的浓度有何关系？分离叶绿体的操作过程中应注意什么？ * *