AM真菌对狼牙刺生长与吸Pb的影响及Pb在菌根超微结构中的定位.docVIP

AM 真菌对狼牙刺生长与吸 Pb 的影响及Pb 在菌根超微结构中的定位 一、实验方案 狼牙刺幼苗生长 3 个月之后，测量叶绿素荧光参数、植物地上和地下部 Pb 含量并利用 TEM 和 EDS 在 AM 超微结构中进行 Pb 定位。 1.1.狼牙刺根系特征 将不同处理狼牙刺的根系放入一透明托盘内，加入蒸馏水，轻轻晃动托盘使根系不再互相缠绕，将托盘放入 EPSON EXPRESSION 1680 型扫描仪中进行扫描，分辨率设为 400 dPi，得到图像之后用 WINRHIZO2003b 根系分析软件进行图像分析，测量狼牙刺的根长、根尖数、分叉数、根体积和根表面积等各项特征参数。根据直径将根系分为 6级，分别为 0~0.2、0.2~0.4、0.4~0.6、0.6~0.8、0.8~1.0和 1.0 mm。 1.2植株地上和地下部 Pb 的分布 把狼牙刺根系放在 pH 8.0 10 mM EDTA溶液中浸泡 30 min 后，用去离子水冲洗掉植株表面附着的金属离子（Hoffmann et al. 2004）。把植株的地上和地下部分放在烘箱中105℃杀青 30 min，然后 70℃烘至恒重，称重，磨成粉末并过 0.1 mm 尼龙网筛。取0.1 g 植物样品粉末，用 HNO3/HClO4（3:1）消解（Wang and Zhou 2003），消解后的溶液用去离子水转移至 25 ml 容量瓶，过滤后利用 FAAS 测定溶液中的 Pb 浓度。 1.3 菌根超微结构的 Pb 定位 1.3.1 透射电镜样品的制作与观察 （1）包埋块的制备 ① 取材：用自来水冲洗“M+0”和“M+1000”处理的狼牙刺须根，并用蒸馏水冲洗干净，拿镊子夹取玉米须根，用锋利的无油污双面刀片将其切成 0.5 cm 大小的根段； ② 前固定：迅速将离体根段放入装有 4%戊二醛固定液的 1.5 ml 离心管中，用真空泵抽去组织内部的气体直到根段下沉至管底，4℃过夜固定； ③漂洗：用0.1 mol/L PBS 缓冲液（pH 6.8）漂洗5次，间隔时间分别为 5、10、15、20、30 min； ④ 后固定：置于 1% 的锇酸中，4℃固定 2 h； ⑤ 漂洗：PBS缓冲液多次漂洗，间隔时间分别为 5、10、15、20和 30 min； ⑥ 脱水：30%乙醇 15 min→50%乙醇 15 min→70%乙醇 15 min→80%乙醇 15min→90%乙醇 15 min→100%乙醇 30 min→100%乙醇 30 min； ⑦ 渗透：包埋剂和无水乙醇 1:1渗透过夜； ⑧ 包埋：先加一滴包埋剂在胶囊底部，再用牙签把组织块送入胶囊底部，将写好的标签放在胶囊的顶部，最后用包埋剂填满胶囊，不能产生气泡，扣上胶囊盖； ⑨ 聚合：将胶囊放入60℃烘箱内 48 h； ⑩ 将组织块从烘箱中取出后，放在干燥器中保存。 （2）修整包埋块 ① 用样品夹夹紧包埋块，在双目显微镜的视野中调好位置； ② 用单面刀片修整包埋块至金字塔形，顶端大约是 1 mm的长方形或梯形，组织 周围尽量不要留有空白的包埋介质，包埋块顶端不宜修除太多，以刚露出组织为宜； ③ 用锋利的双面刀片细修顶端，使上下两边保持平行，有利于得到连续的超薄切片。 （3）半薄定位 ① 将修好的包埋块固定在切片机上，切除顶端多余的包埋剂； ② 将含有样品的切片用甲苯胺蓝染色后，在光学显微镜下观察是否有 AM 真菌结构，若有 AM 真菌结构，表明需要观察的位置已出现，可以在此位置继续进行超薄切片，若无 AM 真菌结构，则继续切片，直到出现 AM 真菌结构为止。 （4）超薄切片 将定位好的包埋块在瑞典 LKB-V型超薄切片机上进行超薄切片。 （5）转膜 将超薄切片固定到 Formvar 支持膜上，并将其转移至铜网上。为避免醋酸双氧铀-柠檬酸铅染色中的 Pb 干扰到根组织本身的 Pb 离子，故本试验的超薄切片只进行醋酸双氧铀染色。 （6）超薄切片 西安交通大学医学院电镜室的 Hitachi H-7650 型号TEM下观察、照相工作电压为 80 KV。 1.3.2 狼牙刺菌根结构 Pb 定位 在超薄切片中寻找样品细胞中电子云密度小体的兴趣位点，利用透射电镜上配备的 EDS（EDAX，USA）能谱仪对其进行定性分析。能谱仪操作条件为：加速电压 200KV，最小光斑直径 80 nm，样品台倾角 35℃，保持 CPS（每秒所读信息量）为 350 左右，收录时间 100 s，分辨率为 133 eV。 结果 2.1 Pb 胁迫下接种 AM 真菌对狼牙刺根系特征的影响 2.2菌根超微结构中 Pb 定位 2.2.1 AM 真菌的半薄定位 2.2.2 菌根超微结构 Pb 定位 图 4-5 图 4-4中 a、b、c和 d 区域能谱分析的结果 Fig. 4-5 T