禽致病性大肠杆菌强素力岛缺失株的构建及致病力评价的研究.pdfVIP

摘 要 禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli，A PEC)引起的禽大肠杆菌病 是一种重要的细菌性传染病，且易与其它病原菌、病毒并发或混合感染，成为养禽业 中重要的细菌性疾病之一。 在耶尔森菌中，参与耶尔森杆菌素(yersiniabactin,Ybt,铁载体）的合成转运和调节 相关的毒力岛称为强毒力岛 （high pathogenicity island，HPI）。其包含有一个携带有 与Ybt摄取、合成和调节有关的fyuA、ybtA、irp1、irp2、irp3、irp4、irp5、irp6、irp7、  irp8和irp9等11个基因的长约30.5kb的功能核心区，天门冬氨酸tRNA （asn­tRNA）是  HPI的整合位点。近年来已有研究表明，大肠杆菌等多种肠杆菌科细菌也普遍携带该 毒力基因群，主要具有铁摄取与调节功能，是赋予细菌毒力和致病性的一个重要的染 色体片段。 为探讨禽致病性大肠杆菌强毒力岛（HPI）在禽大肠杆菌病发病过程中的作用， 以野生型致病性大肠杆菌E.coli (X0904EC02)为原始菌株，依据禽大肠杆菌强毒力岛  irp1~irp9基因的已知序列，利用λ噬菌体Red重组系统对禽致病性大肠杆菌强毒力岛  irp1~irp9基因进行敲除，构建禽致病性大肠杆菌HPI缺陷型突变体。并通过LD 的测 50 定及病理组织切片观察原始株与缺失株在致病力上的差异，探讨HPI与致病性大肠杆 菌的毒力相关性。 禽致病性大肠杆菌HPI缺陷型突变体主要构建步骤为： （1）根据已知大肠杆菌HPI毒力岛基因序列设计PCR敲除引物，设计的引物5′端 有50bp的拟敲除基因的同源臂,3′端为扩增引物。 （2）以pKD3为模板,加入高保真酶PrimeSTAR HS，按照长引物PCR扩增条件扩 增两侧含FRT位点的氯霉素抗性基因,PCR产物一部分经琼脂糖凝胶电泳鉴定， 另一部 分用DNA纯化试剂盒进行纯化回收，并测定DNA浓度。 （3）将此线性DNA转化入E.coli (X0904EC02)感受态细胞中，在Red重组系统表 达重组酶的协助下， 含氯霉素抗性基因的PCR产物通过其两侧的同源序列与禽大肠杆 菌染色体上的基因发生同源重组，通过氯霉素抗性平板筛选得到阳性克隆。 （4）对筛选得到的阳性克隆再导入编码Flp重组酶的质粒pCP20，去除抗性基因， 结合PCR扩增和测序鉴定。结果表明禽致病性大肠杆菌HPI缺陷型菌株构建成功。由 于突变株染色体上的HPI基因序列大部分己缺失，从而造成回复突变的可能性较小。 基于突变株构建的基础上，比较分析了突变株和其野生菌株的毒力性差异。通过  LD 的测定及病理组织切片观察，结果如下： 50 （1） 通过LD50测定结果表明含HPI的禽致病性大肠杆菌标准株E.coli(CVCC1565)  对雏鸡具有一定的致病性，不含有HPI的非致病株对雏鸡不具备致病性；但在攻毒后，  HPI全岛缺失株E.coli(X0904EC02­QS)在攻毒过程中也出现了少量死亡。 I  （2）缺失株E.coli(X0904EC02­QS)攻毒后，病理形态学观察也出现了一些相应 的病理变化，但不明显。  (3)SDS­PAGE蛋白电泳检测，发现出发株在铁螯合剂2,2’­联吡啶浓度为  0.3mmol/L、0.32mmol/L时，  240KD处出现蛋白条带，缺失株未见到任何条带。 本研究表明，APEC毒力与 HPI 存在密切相关性,  携带 HPI 基因的 APEC致病株 在攻毒过程中存在不同程度的死亡，非致病性大肠杆菌没有携带 HPI 基因，在攻毒中 未出现死亡；但是，HPI 基因缺失株在攻毒过程中也有不同程度的死亡，从而提示致 病性大肠杆菌毒力不仅仅取决于 HPI，而是多因素的综合表现。 关键词：禽，致病性大肠杆菌，HPI基因岛，Red同源重组，致病力 II