日本血吸虫DNA免疫的构建及其保护性免疫.pptVIP

日本血吸虫DNA免疫的构建 及其保护性免疫的研究 一.日本血吸虫疫苗的研究的背景 二.日本血吸虫DNA免疫构建实验的步骤 三.实验的结果 四.实验的结果分析及讨论 一.日本血吸虫免疫研究的背景 血吸虫疫苗的研究，既可通过抗感染免疫的途径，也可通过抗病免疫的途径。抗病免疫包含了抑制血吸虫雌虫产卵的抗生殖免疫和抑制虫卵发育成熟的抗卵胚免疫以及抑制虫卵产生和释放免疫病理性抗原等 日本血吸虫产卵量高，致病作用强，虫卵沉积可引起血管堵塞、组织坏死、肉芽肿反应和组织纤维化。虫卵在日本血吸虫对人体的致病过程中起着重要作用。在感染不可能完全遏制时，尽量控制成虫产卵和减轻虫卵造成的病理损害，是防治血吸虫病的又一途径 近年来，信息接头蛋白14-3-3作为早老性痴呆(AD)和人类克-雅病(CJ)的诊断标志引起了人们的关注。Schechtman等证明曼氏血吸虫14-3-3蛋白(Sml4-3-3)能诱导C57Bl／6J小鼠产生25％-46％的成虫减虫率，提示其可能成为抗血吸虫新的疫苗候选分子 血吸虫14-3-3蛋白的研究始于1995年，初步动物实验结果证明，此重组抗原可能具有疫苗应用前景。我们通过肌肉直接注射免疫，观察了该疫苗在血吸虫感染过程中对小鼠的免疫保护作用。 二.日本血吸虫DNA免疫构建的步骤 1．重组真核表达载体pBK-Sj14-3-3的构建 2．免疫保护作用的观察 3．肝脏肉芽肿的变化的观察 1．重组真核表达载体pBK-Sj14-3-3的构建 （1）根据Sj14-3-3编码基因的核苷酸序列设计并合成一对引物 （2）提取日本血吸虫成虫RNA，逆转录生成cDNA第一链 （3）以日本血吸虫成虫cDNA为模板进行 PCR，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定 （4）用限制性内切酶EcoRⅠ和Xho Ⅰ酶切PCR产物和质粒pBK ，酶切后的DNA片段回收纯化 （5）制备感受态细胞，用连接混合物转化感受态细胞 （6）克隆PCR方法快速鉴定阳性重组子；将阳性克隆扩大培养，碱裂解法小量提取质粒 ；双酶切和PCR进一步鉴定阳性克隆 （7）阳性克隆进行核苷酸序列测定确证。用碱裂解法大量提取质粒pBK和pBK-Si14-3-3，754型紫外分光光度计分别测量两种质粒的A260和A280，并计算出含量（S/L）和纯度（A260/A280） 2．免疫保护作用的观察 （1）免疫方案： 20只BALB／c小鼠分实验组和对照组，每 组各10只。各组小鼠在免疫前24 h于后腿股四头肌注射50 μl0．5％的盐酸布比卡因。实验组每只鼠注射100μgpBK-Sj14-3-3，对照组每只鼠注射100μgpBK；3周后相同剂量加强免疫1次 (2)攻击感染： 末次加强免疫5 d后，实验组及对照组每鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(40±1)条 3)减虫率和减卵率： 尾蚴攻击感染6周后，眼眶放血，解剖小鼠收集血吸虫成虫，留取小鼠肝脏备用。分别计数每只小鼠中收集的血吸虫成虫数，计算每组小鼠的平均成虫数和雌虫数，计算减虫率：减虫率=(对照组平均检获成虫数-实验组平均检获成虫数)／对照组平均检获成虫数×100％。称取鼠肝总重量，按常规方法用5％氢氧化钾消化肝组织，计算每克肝组织虫卵数(EPG)，按下述公式计算肝组织减卵率及每对(雌雄合抱)成虫减卵率(EPWP)：减卵率=(对照组平均EPG-实验组平均EPG)／对照组平均EPG×100％ 3．肝脏肉芽肿的变化的观察  （1）各鼠取大约0.5 cm×0.5 cm×0.5cm新鲜肝组织，生理盐水洗涤后置10%福尔马林PBS液中固定，制成石蜡组织块，以7μm厚度连续切片，HE染色后光镜下观察 （2）使用目镜测微尺，选择单卵肉芽肿，测量最大直径，再按垂直方向测量另一最大直径，取其均值，每组以25个单卵肉芽肿大小的平均直径（μm）表示 三.实验的结果 1．重组表达载体pBK-Sj14-3-3的构建： （1）.以日本血吸虫cDNA为模板，用所设计和合成的引物扩增出Sj14-3-3基因。1％琼脂糖凝胶电泳显示，在994bp和697bp之间有1条特异性条带，相对分子质量与理论值765 bP相符 （2）.重组质粒pBK-Sj14-3-3经过限制性内切酶EeoRⅠ、XhoⅠ双酶切和以重组质粒为模板的PCR后，1％琼脂糖凝胶电泳可见1条与PCR产物大小相同的条带，表明重组表达载体构建成功 2.含量和纯度测定的结果: 质粒DNA=(A260×稀释倍数)／20，测得质粒pBK和pBK-Sj14-3-3浓度分别为2.27g／L和2.15 g／L；纯度A260／A280分别为1.910和1.925，在1.8-2.0之间，说明纯度很好 3．减虫率和减卵率的计算结果：