口蹄疫病毒蛋白VP1与细胞蛋白Sorcin互作抑制Ⅰ型干扰素表达的研究.pdfVIP

第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集 口蹄疫病毒蛋白VP1 与细胞蛋白 Sorcin 互作抑制 I 型干扰素表达 的研究 李夏莹，王建昌，李晓齐，王永强，曹红，甘孟侯，郑世军*1 （中国农业大学动物医学院，北京，100193） 摘 要 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性，热性，高度接触传染性动物疫病。尽管已经证实FMDV 引起免疫抑 制，但其引起免疫抑制的分子机制尚不清楚。本研究确认了FMDV 的结构蛋白VP1 与宿主细胞可溶性耐药相关钙结 合蛋白（Sorcin）的相互作用。进一步研究发现，VP1 通过Sorcin 抑制TNF-α 或SeV 诱导的I 型干扰素的表达，影响 病毒（VSV ）复制。 关键词 FMDV ；VP1 ；Sorcin ；免疫抑制；病毒复制 口蹄疫（FMD ）是一种由口蹄疫病毒引起的具有高度传染性的疾病，主要感染偶蹄动物，包括牛、 猪、山羊和绵羊等。口蹄疫的特征是高热，形成水泡，尤其是舌、唇、冠状带、乳头和乳房，以及蹄 部，在幼畜还能引起心肌炎。世界动物卫生组织（OIE ）认为FMD 是影响世界动物和动物产品贸易最 严重的羁绊（1）。 口蹄疫病毒（FMDV ）属于小RNA 病毒科，口蹄疫病毒属，为单链正股RNA 病毒，基因组有8 500 核苷酸（nt ），编码一个大的开放阅读框（ORF ），形成一多聚蛋白，被切割后形成成熟的病毒蛋 白。该病毒有7 个血清型：A 、O、C、SAT1、SAT2、SAT3 和亚洲1 型。病毒粒子具有二十面体结构 的衣壳蛋白，直径为28-30nm ，由四种结构蛋白VP1 、VP2 、VP3 和VP4 各60 个构成。除了四种结 构蛋白外，FMDV 还编码 10 种非结构蛋白（NS ），并且蛋白水解作用还产生一系列的前体蛋白。对 于许多小RNA 病毒来说，病毒翻译过程中的多种中间产物形成了多种不同的病毒功能（2 ）。 VP1 蛋白是FMDV 颗粒表面主要结构蛋白，在其βG 和βH 链之间含有一个高度易变的环（G-H loop ），该环上不仅含有病毒主要的抗原位点，而且含有一个高度保守的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酰 酸（arginine-glycine-aspartic acid, RGD ）基序，而RGD 基序是病毒粒子与细胞表面整联蛋白超级家 族的受体结合从而起动感染的主要结合位点。此外，VP1 还可以诱导宿主产生中和抗体，已经报道V P1 具有关键的抗原表位，可以诱导细胞免疫和体液免疫应答（3 ）。 本研究运用酵母双杂交技术，以FMDV 的结构蛋白VP1 为“诱饵”蛋白，利用猪脾脏cDNA 文库 筛选与VP1 作用的细胞靶蛋白。研究发现与VP1 互作的靶蛋白为Soluble Resistance-related Calcium Binding Protein （Sorcin ）。进一步研究发现，VP1 与Sorcin 互作抑制细胞表达I 型干扰素，影响先天 性免疫力。 1 材料与方法： 1.1 试剂 无内毒素大量质粒提取试剂盒（艾德莱生物公司，北京）；Anti-c-Myc （SC-40 ），anti-actin （SC-1 30656 ），anti-GFP （SC-9996 ）和anti-sorcin （SC-100859 ）单克隆抗体以及protein A/G plus-agarose （S C-2003 ）（Santa Cruz 生物公司，美国）；Anti-FLAG M2 （F1804 ）单克隆抗体（Sigma 公司，美国）； TRITC-标记山羊抗小鼠IgG ，HRP-标记山羊抗小鼠和山羊抗兔抗体（鼎国生物公司，北京）；Lipofec tamine 2000 转染试剂（Invitrogen 公司，美国）；4,6-diamino-2-phenylindole （DAPI ），（Beytime 公司， 南京）；增强型化学发光试剂盒（康为试剂生物公司，北京）；蛋白酶抑制剂（亚太恒信生物公司，北 京）；双荧光素报告基因系统（Promega 生物公司，美国）；重组人源TNF-α （PeproTech 公司，美国）。 1.2 FMDV VP1 从重组表达质粒pMD19-T-VP1 亚克隆得到，使用特异性引物如下：（Sense：5’-A