玻璃海鞘营养成分测定及活性物质的分离分析.pdfVIP

摘要 目前，从海洋背囊动物海鞘中获取各种活性物质的研究正处于高速发展阶段， 但关于对玻璃海鞘活性物质的研究报道至今很少。我国的海鞘资源丰富，特别是山 东沿海海域，与国外相比，海鞘资源不仅没有得到有效地开发，反而困扰着渔业的 发展。本文对玻璃海鞘的营养价值进行了初步分析，并利用化学手段分离纯化玻璃 海鞘提取物，结合药理学方法检测其抗氧化及抗肿瘤活性。 通过对玻璃海鞘中蛋白质、脂肪、氨基酸、脂肪酸等营养成分含量的分析评定 了玻璃海鞘的营养价值；利用乙醇浸提法提取玻璃海鞘浸膏，然后依次用石油醚、 乙酸乙酯和正丁醇对其进行萃取，得到不同极性的萃取物，通过对DPPH 自由基、 脂质过氧化及总抗氧化能力的测定，对玻璃海鞘不同极性萃取物的抗氧化能力进行 了探求；用硅胶柱色谱对正丁醇萃取物进行初步分离，将具有药理活性的正丁醇组 分浓缩，经历多次硅胶柱色谱与凝胶柱色谱分离，得到一系列的组分，采用 MTT 法和磺酰罗明B 蛋白染色等生物活性鉴定方法对玻璃海鞘组分进行了活性跟踪；对 纯度较高的成分进行了HPLC 检测及结构初探，对细胞毒性强的组分A8B2C3 的抗 肿瘤活性作了进一步的研究，采用吉姆萨与Hoechst 染色法观察组分A8B2C3 作用 小鼠黑色素瘤细胞B16F0 后细胞形态的变化，并探讨了组分A8B2C3 对B16F0 细 胞周期分布及对细胞周期相关调控基因表达的影响。 结果显示，玻璃海鞘中人体必需氨基酸占总氨基酸的比值为42.51 %，必需氨 基酸和非必需氨基酸的比值为 73.94 % ；多不饱和脂肪酸含量占脂肪酸总量的 13.8%；玻璃海鞘中含有丰富的Fe 、Zn、Mn、Cu、Ni 等微量元素。用IC50 衡量玻 璃海鞘不同极性萃取物的抗氧化能力，其中正丁醇萃取物清除DPPH 自由基作用最 强；乙酸乙酯萃取物对脂质过氧化的抑制作用最强；在一定浓度下，总抗氧化能力 从强到弱排列顺序依次为：石油醚萃取物 乙酸乙酯萃取物正丁醇萃取物。经过多 次柱层析从玻璃海鞘中分离出三个较纯的组分，其对肿瘤细胞的抑制作用均较弱， 结构初探表明，组分A8B4c5 为腺苷。对玻璃海鞘正丁醇提取物的分离纯化进行活 性跟踪，分离得到5 种具有抗肿瘤活性的组分A1B5C3 、A1B5C6 、A5B2C2 、A6B5 及A8B2C3 。组分A8B2C3 对B16F0 细胞有明显的抑制细胞增殖的作用，在一定浓 度范围内，并可以诱导B16F0 细胞G2/M 期阻滞，随着药物浓度的增加，G /G 期 0 1 I 细胞明显减少，G /M 期细胞显著提高，4.9 µg/mL 时达到17.98 %，较对照组G2/M 2 期细胞 （3.08 % ）明显增多（P ﹤0.01 ），而S 期细胞也有所增加，但增加幅度相对 较小。玻璃海鞘组分A8B2C3 可上调CyclinA2 、p21 、p53 、CyclinE2 的mRNA 水 平，对CDK1、CyclinB1 的mRNA 水平影响不大。 玻璃海鞘营养价值较高，并具有一定的抗氧化及抗肿瘤作用，具有较好的开发 前景，通过分离纯化及活性跟踪得到的组分细胞毒性较好，具有开发成海洋药物的 潜能。本实验为玻璃海鞘资源的开发与应用提供了一定的理论基础，为从玻璃海鞘 中提取活性物质提供了一定的依据。 关键词：玻璃海鞘；活性物质；抗肿瘤；抗氧化 II Abstract Researches on the active substances from the marine tunicates ascidians developed rapidly. But few of studies on active compoun