HPV16 E7“自杀性”DNA疫苗构建及其体外表达特性.pdfVIP

HPV16 E7“ 自杀性”DNA疫苗的构建及其体外表达特性1 1 1 1 1 1 1 1,2 1△ 王红仁 ，王保宁 ，李婉宜 ，左凤琼 ，李 虹 ，蒋忠华 ，施桥发 ，李明远 1．四川大学华西基础医学与法医学院，成都（610041 ） 2. 南昌大学医学院，南昌（330006 ） E-mail ：lmy3985@ 摘 要：目的 构建人乳头瘤病毒16型（HPV16 ）E7基因的“ 自杀性”DNA疫苗，初步研究其体 外表达能力及诱导细胞凋亡作用。方法 以pET32/E7质粒为模板，用PCR方法扩增HPV16 E7基 因，构建真核表达重组质粒pSCA/E7 ，经PCR 、酶切和测序鉴定正确后，将重组质粒转染BHK-21 细胞，然后用免疫荧光技术检测HPV16 E7在细胞中的表达，用dUTP缺口末端标记技术(TUNEL) 进行染色检测其诱导细胞凋亡作用。结果 PCR扩增得到约400bp的目的基因片段，测序结果与 GENBANK 中的东亚型HPV 16序列100%同源。免疫荧光技术检测证实，该基因能在BHK-21细 胞中表达。TUNEL检测证实， pSCA/E7重组质粒能诱导被转染的BHK-21细胞发生凋亡。结论 证实HPV16 E7基因可在BHK-21 细胞中表达，并能诱导被转染的细胞发生凋亡。本研究结果为 HPV16 相关宫颈癌的治疗性疫苗的研究奠定了基础。 关键词：人乳头瘤病毒；宫颈癌；“ 自杀性”DNA 疫苗；治疗性疫苗；细胞凋亡 中图分类号：R373.9 近年来，流行病学和分子生物学的研究已经证实宫颈癌发病与人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染密切相关，尤其是高危型HPV (HPV 16和HPV 18) 。 细胞周期调控及凋亡调节中起重 HPV16 的两个早期编码框架E6/E7基因的表达产物在肿瘤发生、 要作用[1] 。在HPV 16感染引起子宫颈癌的漫长过程中，HPV 16 E7蛋白可以在感染的细胞内持续 稳定表达，并通过与抑癌蛋白Rb结合，干扰其抑制分裂和生长的功能，使细胞从正常向恶性转 变[2,3] 。在HPV 16 E7蛋白中存在有效的T淋巴细胞和B淋巴细胞抗原表位，机体感染HPV 16后可 出现特异性的抗HPV 16 E7 抗体和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)[4] 。因此，HPV 16 E7蛋白成为 HPV16 相关宫颈癌及癌前病变治疗性疫苗的理想靶抗原。 对于病毒相关肿瘤疾病的治疗性DNA疫苗来说，CTL起着至关重要的。但是，一般形式的 DNA疫苗有与宿主基因组整合而使宿主细胞发生转化的危险，而且表达没有自限性，其安全性 难以保证。Berglund等[6]于1998年率先提出了以甲病毒复制子为基础的“ 自杀性”DNA疫苗 (suicidal DNA vaccine)的设想，即利用 “ 自杀性”DNA疫苗的甲病毒进入细胞后能表达出甲病毒 的非结构蛋白（nSPs ），在nSPs 的作用下，甲病毒基因组RNA进行高效复制，在此过程中产生 [7，8] 大量的双链RNA(dsRNA) 中间体，最终可使转染的细胞凋亡 ，因而其复制具有自限性，避免 了与宿主基因整合造成的危险。在甲病毒基因组高效复制同时，目的抗原在亚基因组启动子的 调控下获得高效表达，从而可以较低的免疫剂量引起较强的免疫反应[9] 。研究发现，树突状细 胞（DCs ）可以高效地摄取吸收凋亡细胞，通过交叉提呈（cross-priming ）机制，即由MHC- Ⅰ 类分子提呈，激发强烈的CTL反应[10,11] 。这些特点对于以HPV16 E6、E7等癌蛋白为靶抗原的治 疗性疫苗尤为重要[12] 。因此，我们选用基于甲病毒西门利克森林病毒（semliki forest virus, SFV） 的真核表达载体pSCA1 ，构建HPV16 E7“ 自杀性”DNA疫苗，并研究其在BHK-21细胞中的表达 特性，为继续研究其作为HPV16 相关宫颈癌的治疗性疫苗奠定基础。