质粒pBR322 的温度敏感突变株1）.pdfVIP

第7卷 第斗期 遗 传 学 报 Vol.夕，No.4 1980年 12月 ACTA GENETICA SINICA Dec.，1980 质粒pBR322的温度敏感突变株’‘ 王二力 放世洲 （中国科学院上海生物化学研究所） 携带质粒pBR322的大肠杆菌8021经亚硝基肌诱变后，获得一批温度敏感突变株。携带 这些质粒的宿主细胞在含药 氨（基节青霉素、四环素）培养基中，于300C能正常生长，而于420C 则不能正常繁殖；接种于无药培养基中，即使42℃亦能正常生长。这些突变株中，有四株在 37℃亦能表现温度敏感性。对其中一株进行了高温 (420C）敏感细胞分离的观察，在42℃时， 耐药细胞数目基本稳定，而敏感细胞数 目明显增加。 通过这些突变株对药物抗性的温度敏感性观察、突变质粒 DNA的转化及高温分离现象， 证明宿主对药物抗性的温度敏感性是由于质粒复制部分发生突变所致。 从它们的电泳及 EcoRI酶解图谱来看，在突变质粒的分子量及切点数目上未看到与出发 株的差异。 质粒pBR322121是较理想的基因载体之一，在基因工程研究中已经取得不少突出的成 绩I一‘，“。我们用整体诱变的方法，获得一些pBR322复制温度敏感突变株。只要改变环境 的温度，就可以控制质粒的复制和表达，这为研究质粒DNA的结构和功能提供了一种方 便的条件19-［121a温度敏感质粒用作基因的载体，对重组体检Nli和安全防护都有一定的作 用。 材 料 和 方 法 菌种 Escherichiacoli8021lpBR322）由中国科学院生物物理研究所赠送。586 (rkmkrecC-loplIlig）和C600由法国巴斯德研究所赠送。 诱变剂 亚硝基肌 (NTG）由中国科学院微生物研究所赠送。 筛选平板 营养琼脂，或补加氨基节青霉素 A（p)25微克／毫升、四环素 T（c)20 微克／毫升的营养琼脂。 质粒DNA的制备、转化、EcaRI限制性内切酶作用及琼脂糖凝胶电泳 均按前 文 〕〔进‘行。 实 验 结 果 一（）突变株的诱变及筛选 大肠杆菌8021(pBR322）接种于30毫升肉汤培养基中，370C培养到对数生长期，离 心取得细胞悬浮于1毫升NTG(100微克／毫升，溶于pH7.0磷酸缓冲液）中处理I小时 或（2小时），将细胞悬液离心，去上清液，细胞复悬于200毫升肉汤培养基中，30℃振荡 本文于1979年5月15日收到。 1)本工作承李载平教授提出宝贵意见，戴培桦、朱绳祖同志在工作中给予许多帮助，特此致谢。 308 遗 传 学 报 7卷 培养过夜(27，次／分，往复式康氏振荡器），次日将培养物作不同程度稀释，涂于含药营养 琼脂上，置30℃培养，长出的菌落用影印法或灭菌牙签分别接种在几个含药或不含药平 板上，挑出30℃时在含药培养基上能生长、而42℃仅能在无药培养基上生长的菌落。同 样的方法重复两次。第一次处理 （1小时）的存活细胞中随机挑出31,700个菌落，获得、 个温度敏感突变株；第二次处理 （2小时）的存活细胞中挑出9619个菌落，获得8个温度 敏感突变株。 二（）突变体在不同温度下的耐药情况 将获得的温度敏感突变株 （10株）各取一菌环悬浮于1.5毫升肉汤培养基中，取0.1 毫升接种于5毫升液体培养基中静（止培养），观察不同温度时的耐药情况。所有10株突 变体，30℃在含Ap和Tc培养基中和42℃在无药培养基中都能正常生长，而42℃在含 药培养基中则不能生长。结果表明，突变体的耐药特性对温度是敏感的，在非允许温度 下，耐药性丧失。 突变株8021(pBR322)ts2,ts3,ts6及ts7不仅420C表现耐药的温度敏感性，而且在 37℃也表现出温度敏感性 表（1)0 表1 部分突