一个巨大的多烯抗生素基因簇中聚酮合酶(PKS)基因单元在大肠杆菌中的双重诱导超量表达.pdfVIP

遗 传 学 报，26(6):721-730,1999 ActaGeneticaSinica 一个巨大的多烯抗生素基因簇中聚酮合酶 (PKS)基因单元在大肠杆菌中的 双重诱导超量表达 陶美凤 胡志浩 周秀芬 周 启 邓子新 华（中农业大学生命科技学院 武汉 430070) TobiasKIESER DavidA HOPWOOD (JohnInnesCentre,Norwich,U.K.) 摘要 根据序列分析信息，将链霉菌FR-008中与多烯大环内醋抗生素生物合成直接有关的 PKS基因簇内长2671by的一个PKS单元以正确框架克隆于表达载体pET-15b中P,r7启动子下 游的BamHI位点上，经IPTG诱导只得到微量PKS表达；同样地克隆于pBV220中PRPL启动子 下游的PKS基因在42℃诱导后也不能超量表达出PKS蛋白；然而克隆于串联启动子PRP”或 PRPLP”下游的PKS基因却得到了超量表达。在PRPL耳7下游PKS基因的超量表达依赖于WTG 及42℃两个条件的双重诱导，而42℃及IPTG单独诱导只得到常量表达。而在PR氏启动子下 游时PKS基因在42C1,IPTG单独诱导或42r-+IPTG双重诱导时均可获得超量表达。据此 构建了启动子PR,珠串联排列的表达载体pHZ330·外源基因克隆于该载体起始密码子下游 的多克隆位点时，表达的外源蛋白可用Ni＋十柱亲和纯化。此外，用在大肠杆菌中表达的PKS 蛋白作为抗原免疫大白兔制备了特异性的抗体，Westernblotting实验证明该抗体是PKS特异 性的，可用于PKS基因簇及PKS异源表达的深人研究。 关键词 PKS，串联启动子，抗PKS抗体 分类号 0784 聚酮(polyketide）是一类结构多样且具备多种生物学活性的次生代谢产物，被广泛用 作抗生素、免疫抑制剂、抗癌药 如（红霉素、螺旋霉素、四环素和FK-506等）。根据化学结 构的差别，可将聚酮分为脂肪族聚酮及芳香族聚酮两大类，分别由I,II型聚酮合酶(PKS) 来合成。I型PKS也称作模块结构的多功能聚酮合酶，由多个模块 m（odule)构成多功能的 巨大蛋白质，编码一个模块的DNA片段称作一个单元 u（nit)；每一个模块上有负责一轮聚 酮缩合反应及介拨基加工反应所需的多个结构域，某些结构域活性的有无反映在生物合 成终产物上某个缩合单元上酮基的还原程度。人为改变某些结构域即可得到结构不同的 本文于1998-06--08收到，1998-11-06修回 本研究受国家 自然科学基金和国家教委资助 722 遗 传 学 报 26卷 终产物[t,［zl，因此I型PKS是生物合成化学b（iosyntheticchemistry）研究不可多得的好材 料。 链霉菌FR--008产生一种七烯大环内醋抗真菌抗生素，其化学结构与杀假丝菌素 D(candicidinD）类似[3,［41。胡志浩等克隆了长达105kb的生物合成必需基因簇[5,［61。对基因 簇5一‘端3.8kb的BamHI--Bglll片段进行序列分析，找到编码该聚酮生物合成21个缩合反 应之第1个缩合反应的PKS模块(2（671bp)，编码介酮酞合酶(KS）及酞基转移酶(AT)两 个结构域，与数据库(database)的比较分析表明该PKS属I型PKS；所克隆的基因簇长度 (105kb）也与预期合成杀假丝菌素D的糖昔配基所需的基因长度相吻合。目前该巨型 PKS基因簇的全序列测定已开始，但要完成则仍须假以时日。另外，将这个PKS模块克隆 于植物表达载体上已得到pHZ321l，用于探索高G十C含量的链霉菌抗真菌抗生素基因 簇在植物中表达的可能性，以进行植物基因工程抗病育种前期研究。用该质粒进行转基 因的研究正在进行之中。 我们将这个PKS单元片段克隆于大肠杆菌表达载体上，在大肠杆菌中超量表达了 PKS蛋白；并用表达的PKS蛋白制备了抗PKS抗体，为在蛋白质 酶（）水平上研究FR-008 PKS基因簇提供了必要的研究手段，也为PKS在植物等外源宿主中的表达提供了必要的 检测工具。同时