宏基因组技术及其在环境保护和污染修复中应用.docVIP

宏基因组技术及其在环境保护和污染修复中的应用 张薇1, 2*，高洪文1，张化永2 1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100094；2 华北电力大学能源与环境研究中心，北京 102206 宏基因组学是分子生物学技术应用于微生物生态学研究而形成的一个新概念，以环境中未培养微生物为研究对象，通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建宏基因组文库，利用基因组学策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。从1998年提出至今，该项技术已经广泛应用于工业、农业、医学等研究领域。文在对宏基因组学的概念、研究方法、存在问题的综述基础上提出了相应的解决方法，并指出该技术在环境保护和污染修复中存在潜在的应用价值。利用该技术可以深入了解特定环境中微生物空间分布和动态变化，为环境监测、预警和评价提供理论依据。 宏基因组学；环境保护；生物修复中图分类号：X1 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（200）0-1696-06随着微生物学和现代生命科学的迅猛发展，一门新兴的科学技术——宏基因组学(Metagenomics)，正日益受到专家学者的重视。由于宏基因组学是一种基于无需预先培养来利用环境样品基因组资源，获得活性物质和功能基因的新技术，因而绕过了菌种纯培养障碍，可直接从自然界获取遗传信息，极大拓宽了微生物资源的利用空间，正成为国际生命科学研究最重要的热点之一，并已在土壤生态环境、海洋生态环境和各种极端环境中开展应用。截至2006年，36个环境基因组项目完成或正在进行中。笔者目前正从事环境污染治理及环境与能源微生物的研究，尤其关注利用宏基因组学技术挖掘新物种和新基因，意图在微生物防控污染和能源效应机理方面有所突破。结合自身研究，本文将对宏基因组技术的原理、技术要点及其在环境保护和污染修复中的应用展开论述。 宏基因组(Metagenome)的概念是1998年由美国威斯康星大学的Handelsman教授[1]提出的，最初用来定义土壤细菌的混合基因组，现在则指生境中全部微小生物遗传物质的总和，且主要针对环境样品中细菌和真菌的基因组总和，也称元基因组、环境基因组[2]。其研究策略是直接提取环境中的总DNA，经纯化后部分酶切，再连接到合适的载体上，转化宿主菌，形成一个重组DNA文库。通过功能检测和序列分析等多种手段对获得的克隆子进行筛选，得到目的产物(图1)。因此，宏基因组技术涉及环境样品总DNA的提取、纯化，载体、宿主菌的选择和文库筛选策略多等方面内容，每一部分都对该技术的成功应用产生直接的影响。 获得高质量环境样品中的混合基因组DNA是宏基因组技术的关键步骤。环境样品含有大量理化性质复杂的有机和无机颗粒，微生物仅为其中很小的一部分，且细胞通常紧密吸附于颗粒表面，因此，既要尽可能地完全抽提出样品中DNA，又要保持其较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇，技术水平要求甚高。 尽管如此，科学家们还是摸索出两大类提取方法。一类是原位裂解法，将样品经机械珠打、超声破碎等各种预处理后，直接悬浮在裂解缓冲液中处理，继而抽提纯化。此法操作简单、DNA提取效率高，但由于机械剪切力大，导致DNA片段较小(1-50 kb)且多为平端，不利于建库。另一类是异位裂解法，即先采用物理方法将微生物细胞从样品中分离出来，然后用较温和的方法抽提DNA，如尼可登介质密度梯度离心分离细胞、低熔点琼脂糖裂解DNA、脉冲场凝胶电泳回收DNA。该法适合于提取较高纯度的大片段DNA (20-500 kb)，但操作繁琐，成本高，前分离过程还会造成一些微生物细胞的丢失，温和条件下细胞壁较厚的微生物DNA不易抽提，因此所获得的DNA产率比原位裂解法少10-100倍[3]。研究学者在综合两者优点基础上，试验了多种提取方法，王潇波[4]等分别用研磨/冻融、SDS/蛋白酶K热处理等方法提取了常规土壤、造纸厂污染土壤、温泉水域的环境样品DNA，获得了较高纯度DNA。Fredricks[5]等试验了6种不同的真菌DNA提取方法，并对各种提取方法进行了系统比较。此外，环境中一些金属离子、土壤中腐殖酸、各种抑制剂等物质，会强烈抑制分子操作过程中酶的活性，进而影响DNA酶切、转化、PCR扩增等操作，必须尽量去除。因此，建立环境样品DNA的纯化方法也是在分子水平上研究未培养微生物的一个关键因素。 图1 宏基因组方法技术路线图 Fig. 1 Technical route of metagenomic research 载体在宏基因组技术中具有重要地位，基因组或基因簇能否有效转入宿主细胞并高效表达，很大程度上取决于载体的合适选择。常用载体有质粒(Plasmid)、细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome, BAC)、柯