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PLGA 缓释微球制备条件对蛋白药物活性及免疫原性的影响 PLGA 缓释微球制备条件对蛋白药物活性及免疫原性的影响 摘 要 成功地用于多肽药物的聚合物缓释微球技术至今未能成功地应用 于蛋白药物，主要是蛋白分子的高级结构在制剂过程中脆弱易变、失活 甚至导致有害的免疫反应。实现蛋白药物缓释技术的突破有赖于通过改 善微球制备条件避免蛋白变性及有害抗体的产生。本研究旨在以促红细 胞生成素（EPO ）这样一个具有代表性的蛋白药物为例探讨缓释微球制 备条件对蛋白免疫原性的影响，建立起两者之间的相关关系。 EPO 是目前所有重组蛋白药物中全球销售额最大、也最容易在缓释 剂型制备中发生聚集并产生严重免疫原性的产品，其含有165个氨基酸、 30400Da 的分子量，主要用于治疗肾病、癌症、化疗以及HIV 感染引起 的贫血。由于 EPO 治疗的大多是慢性疫病，用药周期长，目前一周三 次的频繁注射造成了很大的用药顺应性问题。缓释注射剂型可望成为解 决这一问题的理想方案。但是缓释剂型制备过程造成的 EPO 聚集和抗 原化同样可能产生由 EPO 的注射剂引起的强烈的免疫反应—纯红细胞 再生障碍性贫血（PRCA ），使EPO 由治疗贫血的药物变成引发贫血的 元凶。 鉴于微球剂型制备过程中的水-油界面和水-气界面是公认的造成 蛋白聚集的原因，本人所在的研究室开发了诸如低温冷冻相分离、亲水 “油”相中乳化（S-O-hO）等一系列避免水-油和水-气界面的微球制备 PLGA 缓释微球制备条件对蛋白药物活性及免疫原性的影响 新方法，使蛋白在温和条件下与多糖形成可以耐受有机溶剂的玻璃体颗 粒，并在无水条件下乳化成为PLGA 微球。为了验证这些新方法能否如 预期的那样避免蛋白的聚集和免疫原性，本研究运用SEC-HPLC、ELISA 和促UT-7 细胞生长及其抑制法，采用BALB/C 小鼠模型，考察EPO 在 每一微球制备阶段的聚集度、抗体的产生和生物活性的变化。 实验结果证明采用上述无水-油和水-气界面的新方法制备的 EPO- 葡聚糖微粒大小均匀（粒径 1～5µm ）、表面光滑、EPO 的生物活性保 留率较好（90%左右）。达到这一步骤的EPO 没有发生聚集。 上述含有 EPO 的葡聚糖微粒通过亲水“油相”为连续相的无水乳 化法（S/O/hO）包封于PLGA 微球并且与常规的“油包水-水包油”法 （W/O/W ）及“油包固体-油包油”法（S/O/O）进行了比较。三种方法 制备微球的包封率皆为75%左右。 就EPO 的聚集而言，随SEC-HPLC 进样浓度的变化，从W/O/W 法和S/O/O 法制备的微球中回收的EPO 发 生了不可逆聚集。而从S/O/hO 法微球中回收的EPO 发生了可逆聚集。 关于免疫原性，注射了W/O/W 和S/O/O 法微球的小鼠体内的抗EPO 抗 体量明显多于注射了 S/O/hO 法微球的小鼠。细胞抑制实验发现注射了 W/O/W 法微球的小鼠的血清比注射了其它两种方法的微球的小鼠血清 更多地抑制UT-7 细胞的增殖。 SEC-HPLC、ELISA 和UT-7 细胞实验较一致地证明S/O/hO 法制备 的EPO 微球较其它方法在防止EPO 的聚集和免疫原性、保持蛋白活性 上有一定的优势。同时三个方法的一致性也互相证明这三个方法的协同 PLGA 缓释微球制备条件对蛋白药物活性及免疫原性的影响 使用可以作为评价EPO 微球剂型安全性的手段。 关键词：促红细胞生成素，微球，聚集，活性，免疫原性 PLGA 缓释微球制备条件对蛋白药物活性及免疫原性的影响 EFFECT OF FORMULATION PROCESS OF SUSTAINED-RELEASE PLGA MICROSPHERES ON THE PROTEIN ACTIVITY AND IMMUNOGENICITY ABSTRACT The polymer-based microsphere dosage forms successfully applied in