延边黄牛体细胞克隆融合条件的研究.pdfVIP

第 3l卷 第 3期 延 边 大 学 农 学 学 报 Vo1．31NO．3 2009年 9月 JournalofAgriculturalScienceYanbianUniversity Sep．2009 延边黄牛体细胞克隆融合条件的研究 杨月春， 李钟淑， 王士勇， 方南洙 (延边大学农学 院，吉林 龙井 133400) 摘要：以体外成熟培养 22~24h的延边黄牛卵母细胞作为受体，颗粒细胞为供核细胞 ，挤压法 去核，注入供体颗粒细胞到卵黄周隙中，甘露醇融合液中施加 20 s时长的电脉冲刺激使之融 合，复合化学方法激活，从融合前恢复培养时间、融合电场强度 、甘露醇浓度等 3个方面研究延 边黄牛体细胞克隆的适宜融合条件．结果表明，2．5h处理组的融合率(70．9 )显著高于4．0h 处理组 (58．2 ，P0．05)，2．5h处理组重组胚 的卵裂率 (77．9 )显著高于其它 4组 (PO．05)，其它各组间差异不显著 (P0．05)；融合 电场强度 1100V／cm处理组 的融合率 (86．4％)显著高于 900V／cm处理组 (67．1 )和 1200V／cm处理组 (75．2 ，PO．05)，重组 胚的卵裂率 (84．6％)显著高于 900V／cm处理组 (69．6 ，PO．05)，囊胚发育率 (26．1 )显 著高于900V／cm处理组 (10．0％)，1200V／cm处理组 (8．0 ，PO．05)；不同浓度的甘露醇 对融合率和重组胚的卵裂率没有明显的影响，但是 0．28mol／L组囊胚发育率 (25．3 )显著高 于0．25mol／L组 (15．3％，PO．05)．因此 ，适合延边黄牛体细胞克隆的融合条件为融合前恢 复培养 2．5h，0．28mol／L甘露醇作为融合液，电场强度 1100V／cm． 关键词 ：延边黄牛 ；体细胞克隆；电融合 ；重组胚 中图分类号 ：$814．6 文献标识码：A 文章编号 ：10O4—7999(2009)03—0153—06 体细胞克隆技术中，供、受体的融合过程是影响重组胚后期发育的一个重要因素，在体 细胞克隆过程中，电融合是通过在非电解质(或弱电解质)溶液中施加直流电，使相互接触的 供体细胞和受体细胞质膜产生瞬时微孔，逐渐融合在一起形成一个细胞．由于电融合技术具 有融合率高、重复性好 、效果稳定等特点，因此该方法 自1986年 Willadsen得到发育足月的 克隆绵羊[1]以来被广泛采用．近年来，国外利用电融合技术进行体细胞克隆研究 已在绵 羊[、山羊[、牛[、小鼠[]和猪[]等动物上取得成功 ，国内在水牛[、盘羊和萨能山羊[8]等 动物上也做了研究，表明电融合条件对核移植胚的融合和体外发育均有明显影响，从而影响 体细胞克隆的效率．但是 由于不同实验室的 自然条件不同，适宜的融合液浓度、融合 电场强 度等融合条件也不同，所 以有必要研究适宜延边黄牛的电融合条件．本试验使用新鲜的卵泡 颗粒细胞作为供核细胞，初步探讨延边黄牛体细胞克隆的适宜电融合条件． 1 材料与方法 1)主要仪器与材料 显微操作仪(DM，德国LEIKA)，细胞融合仪(CRY一3，宁波新科)， 收稿 日期 ：2009一O4—20 基金项目：延大研科合字(2008第 6号)；国家 自然科学基金项 目 作者简介：杨月春(1981一)，女，吉林辽源人，延边大学农学院，在读博士．方南洙为通讯作者， TelE—mail：nzfang@ybu．edu．cn 154 延 边 大 学 农 学 学 报 第 31卷 CO2培养箱(TC2323，美 国SHELLAB)，恒温板 (PW一1，日本 FHR)，拉针仪 (PN一30，日本 NARISHIGE)，磨针仪 (EG一30，Et本 NARISHIGE)． 2)主要试剂与液体 除胎牛血清 (FBS，北京鼎 国)外，其余试剂均为 SIGMA公司产 品．卵巢保存液为添加双抗的生理盐水，冲卵液为添加 5％FBS的TCM199液，卵母细胞成 熟培养液为添加 10 FBS、1