一种基于电化学发光技术的高灵敏度PS-1基因点突变检测方法.pdfVIP

维普资讯 讲 学屯 舷 第48卷第13期 2003年7月 简 报 一 种基于电化学发光技术的高灵敏度 PS．1基冈点突变检测方法 朱德斌 邢 达 沈行燕 闫贵虹 (华南师范大学激光生命研究所，广 ¨I510631．联系人，E—mail：xingda@scnuedu．cn) 摘要 电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)分析是20世纪90年代初发展起来的一种高灵敏度检 测方法，它将电化学法和化学发光法巧妙结合，利用金属钌的复合物和三丙胺在电极表面发生氧化还 原反应而产生高效、连续、稳定的发光，具有灵敏、快速、准确、操作简便和分析适应性广等特点，已 被应用于核酸的定量分析之中．将电化学发光技术应用于基因点突变检测，采用了一种基于 PCR技术 和限制性内切酶技术的电化学发光分析方法检测Presenilin一，基因(简称P一，基因)密码子235处发生的 点突变．结果显示，在 PCR 循环次数相同的条件下，野生型样品酶切前后的电化学发光信号强度基本 保持不变；突变型样品酶切前后的电化学发光信号强度变化显著．该方法可明显区分野生型样品和突 变型样品，可望用于老年性痴呆病的早期诊断． 关键词 电化学发光 点突变 Ps—基因 电化学发光 (electrochemiluminescence，ECL)分 广泛应用于核酸的定量分析之中 析方法是20世纪90年代初发展起来的一种高灵敏度 检测方法，其工作原理如下：以一定的电压能量作用 一 于工作电极上，2价 的 联吡啶钌 R【u(bpy)3】在电极 表面发生氧化反应，释放出1个电子而成为3价的三 l啦 联吡啶钌[Ru(bpy)~】；与此同时，反应体系中的三丙 爆 胺(TPA)也在电极表面发生氧化而成为阳离子 自由基 米 TPA”，并迅速 自发脱去一个质子而形成 自南基TPA． 由于[Ru(bpy)~】是强氧化剂，而TPA是强还原剂， 波长 ／nm 两者随即发生氧化还原反应，其结果使[Ru(bpy)~】 图l[Ru(bpy)~】的荧光光谱 还原成激发态的Ru(bpy)~；激发态的Ru(bpy)~以 示二 甲基 甲酰胺在激发波长为 456rim时的荧光光谱．2示溶于二 甲 荧光机制衰变，释放出 1个中心波长为6l4nm的光 基甲酰胺的fRu(bpy) 在激发波长为456rim时的荧光光谱 子(图1)，成为基态的Ru(bpy)~；基态的Ru(bpy)~继 编码早老蛋白的Presenilin一，基因(简称 PS．，基 续参与发生在电极表面的化学发光反应，使电极表 因)是早发家族性老年痴呆(early—onsetfamilialAlz— 面的氧化还原反应循环进行，该过程不断释放出光 heimer’sdisease，FAD)的主要致病基 因[5-8]，位于 子；随着光子计数器计数时间的增加，测定信号不断 P一，基因外显子 8上的密码子 235发生点突变能引 增强，从而进一步改善了信噪比并大大提高了检测 起 FAD，该突变点由于 Campion等人lu首次发现． 灵敏度．与其他几种标记技术相比，ECL有许多优点： P一，基 因密码子235突变引起 FAD的发病年龄为29 无放射性危害，是一种在电极表面 由电化学引发的 — 35岁问，是 目前所发现的各例 FAD 中发病年龄最 特异性化学发光反应：灵敏度高，检测线性范同达 5 早的病例，这说明密码子 235突变对 P一，基因的功 个数量级，下限值为 200fmol／L；检测速度快，检测 能可能有激烈的影响．因此，可通过检测该点突变对 仅需几十秒到几分钟；与其他化学发光