第六章+电泳分离技术.ppt

第五节 凝胶电泳 Nucleic Acid Sequencing Gels (3). The DNA conformations influence electrophoretic migration 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)早在1959年由Raymends和 Weintraub．L建立。1964年，此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推广应用。由于具有较高的分辨率和灵活性，目前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离和分析。 缺点： ①电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀，可在样品中多加些两性电解质。 ②许多蛋白质在pI附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子去垢剂解决。 六、变性梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳（denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE） 温度梯度凝胶电泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE） 恒定变性胶电泳（Constant deratarared gel electrophoresis，CDGE） 分离原理： DGGE、CGGE及TGGE三种方法是基于相同的原理而设计的突变检测方法，它仍均是根据DNA的解链特性而设计。 对于同一定序列组成或的DNA片段来说，它具有恒定的解链温度（Tm），但若其序列发生改变时，Tm值亦发生改变，在含有变性因素（变性剂，高温）的凝胶中进行电泳，当其比链解开形成分叉时，电泳迁移的速度就会改变。 Tm值主要取决于DNA的碱基组成，序列中出现单碱基替换时，Tm亦发生改变，电泳迁移率亦改变，此即DGGE、CDGE及TGGE鉴定突变的技术基础。 1、变性梯度凝胶电泳（DGGE） DGGE是检测基因突变故为精确的方法，它不仅可检测单一片段的单点突变，对多点突变的检测亦较容易，该方法与PCR技术相结合，使其能非常快速的对大量标本进行分析。 对于一DNA片段来说，其Tm值与基碱基组或有关，当其碱基组成发生变化时，Tm值亦改变，因此，对于突变的片段来说，若其在一变性物质线性梯度增加的凝胶上进行电泳时，随着变性剂浓度的增加，当这种浓度达一定值时突变的DNA片段发生解链而形成分叉，其电泳迁移速度变慢。因此突变的DNA片段与正常的DNA片段电泳的迁移位置有差别，研究证明DGGE可检出任何粪型的单碱基取代，如果将突变型与正常的DNA片段形成异源双链时，其敏感性大大提高。 实验流程DNA样品的提取→ PCR扩增→ DGGE电泳→ 带型分析→ 特征条带的测序 DGGE的应用环境样品细菌、古细菌、真菌、真核微生物的多样性分析（土壤、水等样品无需培养，直接提取DNA扩增检测）动、植物体内外共生微生物的检测；食品微生物的检测；医学领域碱基突变的检测，杂合子检测等等。 2、温度梯度凝胶电泳（TGGE） 该方法是将PCR扩增的产物量一中性聚丙烯酰胺凝胶上，在一温度线性梯度上升的电场中进行电泳，当DNA双链到达其Tm时，双链解开，形成分叉，而影响电泳迁移率，突变的扩增产物其Tm值与野生型有明显不同，因而有不同的解链区，从而造成电泳迁移效率的差别，据此可判断检材中DNA有无突变。 3、恒定变性胶电泳（CDGE） CDGE是DGGE基础上发展起来的基因突变检测技术，亦是利用突变基因与正常基因片段间Tm值的差异来检测突变的方法，该方法与DGGE的区别在于聚丙烯酰胺中含的变性剂浓度相当于含突变基因片段的Tm值，而且浓度恒定，而不是线性递增。 为了提高DGGE和CDGE的检测敏感性，通常在一侧引物的5端设计一含GC的区域（GC-ClampGC钳），避免了DNA的完全解链，从而提高了突变的检出率，可达100%。 七、蛋白质印迹 蛋白质印迹方法将高分辨率的电泳技术与灵敏的、专一的免疫探测技术结合起来,用针对蛋白特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针进行检测.对于蛋白质,通常使用的探针是抗体,它与附着于固定基质上的靶蛋白发生特异性反应. Western blotting原理图示 双脱氧末端终止测序法的基本反应：GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA DNA序列分析法:双脱氧末端终止测序法 变性梯度凝胶电泳系统（DGGE） 温度梯度凝胶电泳（TGGE） 第五节 凝胶电泳 电泳印迹 ?电泳转移即电泳印迹。它是利用低电压，大电流 的直流电场使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上 。 第六节 毛细管电泳 第六节 毛细管电泳 电泳是电解质中带电粒子在电场力作用下，以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象.利用这种现象对化学