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霍乱弧菌实验室检测技术 北京市海淀区 疾病预防控制中心 提纲 O1群霍乱弧菌的流行情况 1817年~1923年发生六次霍乱的世界大流行 均由O1群霍乱弧菌古典生物型引起 1820年古典生物型引起的霍乱首次传到我国 1961年开始了第七次霍乱的世界大流行 均由O1群霍乱弧菌埃尔托生物型引起（1905年发现） 1961年埃尔托生物型霍乱首次传到我国 O139群霍乱弧菌的流行情况 1992年印度马德拉斯发生O139霍乱并迅速传播 1993年6月我国新疆发现O139霍乱流行。 1994年我市发现O139霍乱疫情 霍乱的生物学性状 霍乱的生物学性状 霍乱的生物学性状 霍乱的生物学性状 霍乱的生物学性状 霍乱的生物学性状 霍乱的生物学性状 霍乱的生物学性状 样本的采集 检验操作程序 检验操作程序 霍乱弧菌在庆大培养基上菌落形态。(菌落呈现无色 、圆形半透明、湿润、扁平或稍突起、边缘整齐，由于亚碲酸钾的作用，菌落中央常呈灰色或灰黑色） 检验操作程序 检验操作程序 检验操作程序 检验操作程序 检验操作程序 检验操作程序 检验操作程序 检验操作程序 检验操作程序 检验操作程序 检验操作程序 药敏试验注意事项 每次药敏试验必须用ATCC 25922大肠杆菌做质控 使用的MH培养基不能太薄 使用的MH培养基PH值应为7.3 抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限 不可用过期的试剂和药敏纸片 荧光定量PCR方法鉴定 探针和引物 GACTCACCTTCGATTTCAGCAA SO1F GAATAACTCAAGGCGATGAAGTGAT SO1R FACGGGTAACGCACCACACTGGACTATGP O1 probe FAGCATTCCCACAACCCGGCGP CT probe AAGAGCCGTGGATTCATCATG SCTXR TTTCATCGCAAGTATTACTCATCGA SCTXF FAAACAGTCGACCGGCGATAAACGCTP O139 probe TGCATAATACTTTCGACCATGGA SO139R GCGGTGTAGCGGGTTTTATTAG SO139F 荧光定量PCR方法鉴定 模板的制备： 挑取数个菌落加入装有100μＬ去离子水的1.5mL 管中,混匀后100℃ 10分钟，12000转/分钟离心5分钟，取上清液作为模板。 * * 霍乱的流行情况 霍乱的生物学性状 样本的采集 检验操作程序 荧光定量PCR方法检测O1群、 O139群霍乱弧菌及霍乱毒素 由O1群、 O139群霍乱弧菌引起的霍乱以发病急、传播快、波及范围广、能引起大流行为特征，被世界卫生组织列为国境卫生检疫传染病，也是我国传染病防治法中规定强制管理的甲类传染病。 O1群和O139群霍乱弧菌与其他霍乱弧菌的最大区别是能产生相同的霍乱毒素 弧菌的分类 形态与染色 抗原结构、血清群 生长与培养特性 生化反应特性 对外界的抵抗力 药物敏感性 弧菌的分类（包括5个属） 弧菌属 霍乱弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌、河弧菌等等 气单胞菌属 邻单胞菌属 发光菌属 水栖菌属 形态与染色 革兰氏染色阴性，两端钝圆或稍平 单鞭毛、鱼群样排列，菌体弯曲呈弧形或逗点状 暗视野显微镜下，霍乱弧菌运动活泼，呈穿梭状或流星状 培养基上菌落略带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润 革兰氏染色阴性，两端钝圆或稍平 单鞭毛、鱼群样排列，菌体弯曲成弧形或逗点状 抗原结构、血清群 H抗原和O抗原 根据O抗原不同，分为200多个血清型 根据O抗原成分的不同分群特异性抗原因子和型特异性抗原因子 O1群据型特异性抗原成分不同分为小川、稻叶、彦岛三个血清型 小川型含A、B抗原因子，也含少量C因子成分 稻叶型含A、 C因子 彦岛型含A、B、C因子 生长与培养特性 好氧同时兼性厌氧，最适生长温度37℃ 钠离子可刺激生长 耐碱不耐酸 初次分离时常用碱性蛋白胨水(pH8.8-9.0)增菌培养， 霍乱弧菌经6～8h增菌后可在液体表面大量繁殖，形成菌膜 生化反应特性 两个生物型的霍乱弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖 产酸不产气 迟缓发酵乳糖，不分解阿拉伯糖 氧化酶试验 弧菌属细菌大多为阳性 粘丝实验 弧菌属细菌大多为阳性 对外界的抵抗力 在河、井、海水中可存活13周以上 食物和海产品上存活7天左右 对低温和碱耐受力强 （在食品上的弧菌于冰箱保存（0~5度）比室温存活时间长） 对热、干燥、太阳直射敏感 对含氯制剂、碘制剂敏感 对酸和强氧化剂极敏感 煮沸100度1~2min即可被杀死 药物敏感性 细菌带有可传递的耐药质粒 近年产生多重耐药株（丁胺卡那霉素 、强力霉素、复方新诺明 ） 诺氟沙星和环丙沙星对霍乱