流式细胞仪在睡眠性阵发性血红蛋白尿的诊断中的应用_百替生物58321.pdfVIP

流式细胞仪在睡眠性阵发性血红蛋白尿的诊断中的应用 睡眠性阵发性血红蛋白尿PNH 睡眠性阵发性血红蛋白尿（PNH）是一种获得性造血干细胞异常，临床主要表现为骨髓丧失造血功能、血栓、 慢性溶血性贫血急性发作。PNH 的发病率很低，发病原因不详，可能与再生障碍性贫血有关系。PNH 的临床 表现不一，疾病进程多变，给临床的诊断治疗和疾病研究带来很多困难。最近15 年，在PNH 的细胞和分子 生物学研究中取得了重要进展，定义了导致PNH 异常表现的分子缺陷。而使用流式细胞仪进行PNH 诊断分 型，是PNH 研究的又一里程碑。 历史回顾 Strubing 早在一个世纪之前，就第一次报告了PNH，症状为溶血性贫血，伴有夜间血红蛋白尿。50 年后， Ham 和Dingle 证明了PNH 患者的红细胞在血清酸化条件下，易发生溶血，这就是现在普遍使用的Ham 实验， 用来诊断PNH。不久，又发现PNH 的溶血是由于患者的红细胞对补体敏感。进而又发现PNH 患者的中性粒细 胞和血小板也有异常。Dacie 在1963 年提出了PNH 是由于干细胞突变造成的获得性克隆异常的假说。后来， 通过对两位患有PNH 的妇女的异构酶葡萄糖6 磷酸脱氢酶的研究，证实了这一假说。PNH 红细胞中只含有一 种异构酶，而病人正常红细胞中含有两种异构酶。 生化缺陷 1983 年，PNH 红细胞的生化研究表明，PNH 缺乏一种被称为延迟加速因子DAF 的补体调控蛋白。这种蛋白抑 制补体C3 转换酶的形成，并通过glycophosphatidylinositol （GPI）的锚定作用（翻译后处理步骤）固定 在细胞膜上。进一步研究表明，PNH 细胞缺少这种通过GPI 与细胞膜的正常连接。这意味着，GPI 锚定蛋白 的合成异常，是PNH 的起因。PNH 细胞系的GPI 合成的生化通路也异常，这种异常发生在通路的第一阶段的 N-acetylglucosamine 到phosphatidylinositol 的转移过程中。 分子缺陷 1993 年Miyata 等发现了PHN 的基因缺陷。通过对一系列复杂的补体和转染研究，证实了PNH 细胞系的 phosphatidylinositol glycan complementation class A （pig-a）基因表达了错误的GPI 相关的抗原。 对pig-a 基因进行序列分析，发现迄今为止，所有报导过的PNH 病人都有pig-a 基因的突变。由于这种突 service@100 变发生在体细胞，所以表现不一致，并且在整个pig-a 编码区域中，都有发生突变的可能。这些突变包括 缺失、插入和点突变。所有的缺失和插入部分都很小（只有一到二个），导致漂移突变，产生了无功能产 物。漂移突变导致了细胞完全缺乏GPI 锚蛋白（III 类细胞）。另一部分突变是点突变，保留部分活性，可以合成少部分的GPI 锚蛋白。这种突变 细胞表达部分GPI 锚蛋白（II 类细胞）。由于pig-a 基因位于X 染色体，每个细胞只有一个功能性pig-a 基因（女性X 染色体失活），因此，单一突变会造成GPI 缺失表型。相反，每个细胞中都有两个具有活性 的常染色体pig 基因，只有常染色体上两个等位基因都发生突变，才会产生PNH 症状。 流式细胞仪分析 使用分子生物学已经成功发现了PNH 的基因缺陷，而使用单克隆抗体和流式细胞仪技术则是发现诊断PNH 表型异常的重要手段，具有同样的重要意义。1985 年，两个各自独立的小组使用流式细胞仪和DAF （CD55） 抗体，调查PNH 患者，发现了缺乏DAF 的红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血小板。这都证明PNH 的多系特征，有力支持PHN 是克隆性干细胞疾病的学说。进一步分析PNH 病人骨髓造血干细胞，发现也缺 乏DAF 的表达。之后，随着新的GPI 锚蛋白单克隆抗体的出现，PNH 的研究又进一步深入。Van der Schoot 等发现PNH 患者中性粒细胞缺乏CD16、CD24 和CD67 （后来有更名为CD66b）。同时，他们第一次证明在PNH 诊断中，流式细胞仪检测优于Ham 实验。在研究中，他们分析了16 例再生障碍性贫血的病人，在3 例病人 的粒细胞中发现了少量PNH 克隆，而这3 例病人Ham 实验均阴性。后来有人又进一步证实了一些严重再生 障碍性贫血的病人有GPI 缺乏的粒细胞和单核细胞，而红细胞可以正常。于是，流式细胞仪诊断PNH 的可 靠方法很快建立起来，同时，还用来判断PNH 的疾病程度和PNH 克隆的造血细胞系别来源。现在，尽管目 前使