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引物的应用常识 引物的原理 引物是短的寡核苷酸片段，充当 DNA 复制的起点。因为几乎所有 DNA 聚合酶都不能从 头合成，所以它们需要一个 3’-羟基作为 DNA 合成的起始点。这个 3’-羟基由相配的引物提 供。在体内，由于 DNA 聚合酶的忠实性，不能从头合成 DNA，因此只能由 RNA 聚合酶（称 为引物酶）生成，采用 RNA 引物来延伸，在延伸过程中，RNA 引物降解并由 DNA 取代。 在体外 PCR 反应中所用到的 DNA 引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学 法人工合成的，与模板形成双链后在 DNA 聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多 数 PCR 反 应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。 1. 不同实验要求的引物选择 在开始设计引物之前，必须弄清以下几点： （1）明确 PCR 的目的（例如克隆、SNP 检测、定量检测等） （2 ）确定样品材料（基因组 DNA、RNA、微小 RNA） （3 ）确定 PCR 的类型（普通的、定量 PCR、RT-PCR、长片段 PCR)，在查找序列的时候 还需要考虑可能存在的问题（如假基因等） 2.引物设计的重要因素 有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。引物设计的软件如 Oligo 6.22 ， Premier 5.0，Primer Express 3。引物分析常用 Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。目前 生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件 Primer 3 plus， • 引物长度和专一性 常见的引物长度为 18-30 个碱基。 短的引物（≤15 碱基）能非常高效地结合, 但是 它们的专一性不够。较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致 PCR 产量低下。同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。 • 平衡 GC 含量，避免 GC-和 AT-富集区域 引物的 GC 含量应介于 40%～60%之间。应避免聚- （dC ）-或聚（dG ）-区域，因 为它们会降低退火反应的专一性。聚- （dA ）-和聚（dT ）-也应避免，因为这样会形 成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。 • 3’-序列 3’端为 G-或 C-核苷酸较好，因为能增加结合强度。同时它将提高 PCR 效率，因为 引物-模板符合物的开放将达到最小。但是，超过 3 个 G/C 碱基将会具有负面效果， 因为会降低反应的专一性。 • 避免互补的引物序列 引物设计应避免引物自身序列的互补性超过 3 个碱基。因为这容易使引物形成自身 发夹结构。 上下游引物之间的互补配对也应避免，尤其在作为扩增起始点和关键区域的 3’端。因为这 将导致强引物二聚体形成，后者将与所需要的 PCR 反应竞争资源，导致 PCR 效率降低， 在极端情况下，甚至导致完全无特异性目的产物生成。 • 退火温度是基于引物的解链温度（Tm ）计算方法。 最常用的解链温度计算公式如下三种：“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于 14 个碱 基以下引物有效， 另外，还有 GC 法则，适用于长于 13 个碱基的序列，这两种方法都相对不准确。 “盐调整”法相对准确一些，考虑到了反应缓冲液中的中的 Na+离子浓度(50 mM Na+ ,pH 7.0)。 但是不管根据哪种方法计算出的解链温度，都可用于估算最佳退火温度，也都仅作为实验参 考温度。 引物使用的常见问题： Q-1：OD 值的概念？ A-1: OD 是 optical delnsity （光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，OD＝1og （1 ／trans ），其中trans 为检测物的透光值。 吸光度（absorbance ），是指光线通过溶 液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它 的因素有溶剂、浓度、温度等等，吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要 光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。引物是以 OD260