第四章 目的基因的分离 3.pptVIP

第四节 基因突变与修饰 体外诱变(in vitro mutagenesis)是指对克隆化基因进行诱变处理，改变其核苷酸序列，获得突变基因以用于研究基因结构与功能的技术。 随机诱变包括化学诱变、盒式诱变和嵌套缺失突变等，突变范围广、效率高，重复性差。 定点诱变包括PCR介导的定点诱变和寡核苷酸传导的定点诱变，突变效率高，突变位点可以精确控制。 一、随机诱变 易错PCR 易错PCR是一种简便快速地在DNA序列中随机制造突变的方法，它通过改变传统PCR反应体系中某些组分的浓度，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变。本法的关键在于选择适当的突变频率，当突变频率太高时，几乎无法筛选到有益突变；若突变频率太低，野生型将占据突变群体的优势，也很难筛选到理想的突变体。 费力、费时，且易出现同型碱基转换 易错PCR 二、定点诱变 重叠延伸PCR 重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。 三、DNA改组技术 DNA改组原理 与常规突变技术相比，DNA改组有以下显著优点： ①DNA改组可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可以达到几十kb； ②通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高； ③DNA改组从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片断上序列的信息，简化了操作程序； ④DNA改组比随机突变显著提高了良性突变的概率。研究表明，DNA改组比随机突变具有较大的优势，随机突变的方法一般产生1%的良性突变，但DNA改组可产生13%的良性突变。 * 重叠延伸PCR技术流程 A、D分别表示基因上下游引物；B、C分别表示靶位点正反向突变引物；基因上的黑色区域为靶位点，NNN表示兼并引物或突变核苷酸 DNA Shuffling DNA改组 DNA洗牌 DNA搅乱重排 1994年，Stemmer等，用DNA Shuffling技术体外快速进化蛋白——有性PCR法 1997年 ，France Aronld研究组将DNA Shuffling技术做了改进——交错延伸法 DNA改组是DNA分子的体外重组,是基因在分子水平上有性重组。通过改变单个基因(或基因家族)原有核苷酸序列,创造新基因,并赋予表达产物以新功能。实际上,该技术是一种分子水平上的定向进化。因此也称为分子育种。在创造新基因的过程中,要设法产生各种变异。这主要通过有性PCR、交错延伸PCR完成。 值得指出的是,DNA改组的效果必须由改组后的基因表达产物的功能来验证。因此,灵敏可靠的筛选方法是DNA改组技术成功与否的关键。 DNA重组装原理图 (DNA shuffling) 1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段 *