KLF4在血管平滑肌细胞胞质中定位和功能及研究.pdfVIP

中文摘要 KLF4在血管平滑肌细胞胞质中的定位和功能 摘 要 smoothmuscle 目的：血管平滑肌细胞(vascular 化是高血压、动脉粥样硬化、血管再狭窄等血管重塑性疾病的主要细胞病 factor 理学基础。KLF4(Kmppel．1ike 员之一，该家族是具有锌指结构的一类转录因子家族，广泛的参与胚胎发 育、细胞分化和癌症发生等过程。KLF4主要定位于胞核，通过激活分化 标志基因(如SM 化的作用。目前对KLF4功能主要局限在细胞核，关于KLF4在胞浆的分 布及其功能尚少有报道。我们前期研究发现，PDGF．BB可以促进KLF4 表达和核输出，但KLF4在胞浆中的定位和功能尚不清楚。本研究以 PDGF．BB为诱导因素，探讨了KLF4调节细胞骨架重构的分子机制。 方法：细胞免疫荧光染色分析检测KLF4与细胞骨架的相互作用； Western blot分析检测KLF4出入核的途径；GST 活性的影响。 结果： 1 CRMl介导KLF4出核 用CRMl阻断剂LMB(20 8h后，再给予 ng／mL)预处理VSMC PDGF．BB(20 2h，分别提取胞浆蛋白和胞核蛋白进 ng／mL)刺激VSMC 行Westernblot分析。结果显示，与对照组相比，LMB可以显著抑制 诱导KLF4核输出。 2 KLF4参与细胞骨架重构，具有稳定细胞骨架的作用 位的变化。细胞免疫荧光染色结果显示，对照组细胞含有大量平行束状纤 中文摘要 维，PDGF．BB刺激后，束状分布的应力纤维减少，肌丝排列成为网状。 CB刺激后，应力纤维消失，微丝解聚，呈弥散状分布于胞质中，细胞无 法维持正常的形态。相反，JPK则使细胞应力纤维变的粗大。KLF4过表 激，肌丝仍保持束状排列，没有明显的网格化改变；还发现过表达KLF4 也可以抵抗CB诱导的应力纤维解聚，提示，KLF4在胞浆中有稳定细胞 骨架的作用。 3 KLF4通过与actin相互作用参与细胞骨架重构 为了明确KLF4参与细胞骨架重构及稳定细胞骨架的作用是否与其 和SM 2 相互重合为黄色荧光；CB使肌丝解聚为弥散状，且胞浆中TRITC标记的 过与actin相互作用调节细胞骨架的解聚和聚合。 4 不同截短体表达质粒转化宿主菌，经IPTG诱导后通过GST亲和层析纯 4B与 VSMC融合蛋白裂解液共9呼育8h，沉淀经充分沈涤后，进行SDS．PAGE 分离及Western 相互作用，其他融合蛋白上结合的actin较少。以上结果证实，KLF4分子 中第117．181位氨基酸是actin与KLF4相互作用的结构域。 5 KLF4磷酸化和苏素化修饰影响细胞骨架的重构 为了确定KLF4修饰与细胞骨架重构的关系，我们分别用KLF4磷酸 化位点Seb25 察不同突变体对细胞骨架重构的影响。结果显示，没有给予PDGF-BB处 理时，各转染组细胞骨架均为束状，无明显区别；但是给予PDGF．BB后， 中文摘要 转染磷酸化位点突变体的细胞，细胞骨架发生明显改变，表现为应力纤维 增粗，向细胞边缘聚集，细胞形态由长梭形变为多角形。转染苏素化位点 突变体后，应力纤维也增粗，但排列明显无序紊乱。提示PDGF．BB诱导 的KLF4磷酸化和苏素化均参与了细胞骨架重构的调节。 结论： 1 CRMl介导KLF4出核 2 KLF4参与细胞骨架重构，具有稳定细胞骨架的作用 3 KLF4通过与actin相互作用参与细胞骨架重构 4 5 KLF4磷酸化和苏素化修饰影响细胞骨架的重构 英文摘要 FunctionofKLF4in