RNA干扰介导Prohibitin基因沉默对人大肠癌细胞株生物学特性影响.pdfVIP

生物学特性的影响 中文摘要 的表达，研究PHB基因对大肠癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的调节作用，为运 用RNAi技术治疗大肠痛的可行性奠定理论和实验基础。 方法：以Westernblot检测PHB在多株大肠癌细胞株中表达，筛选出高表达 PHB蛋白细胞株，以该株细胞为研究对象，在尘长状态良好情况下瞬时转染针 比较基因沉默后蛋白的表达，筛选出干扰效果最明显的两个片段，设立阴性对照 和筛选出的两个siRNA片段为实验组，重新转染该株大肠癌细胞，抑制靶基因 PHB表达，通过CCK．8检测、平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验等检测 细胞增嫡能力。在奥沙利锦药物诱导基础上，通过PI和RNase流式枪测细胞周 期：Annexin 等方法检测细胞凋亡；AnnexinV．FITC试剂和Hoechst染色荧光显微镜观察， 记录细胞典型凋亡形念和细胞核改变。 结果：Westernblot结果显示PHB蛋白在七株大肠癌细胞中均有表达，且在 HCT 116 116中表达最高。靶向PHB特异性RNAi化学合成片段，瞬时转染HCT 后，三个片段均明显抑制蛋白表达，且片段PHBl38、PHB539抑制效果更好。细 胞增殖能力检测结果，CCK．8法绘制细胞生长曲线发现转染siRNA沉默PHB基 1 因后可抑制HCT16细胞的生长；通过平板克隆和软琼脂克降形成实验检测PHB 对细胞体外成瘤能力的影响，发现转染后HCT116细胞克隆数量少于阴性对照 通过细胞周期分析，发现转染沉默HCT116细胞后S期细胞比例下降，凋亡峰 ％；应用Annexin V—FITC细胞凋亡试剂盒流式检测也同样发现D2区显示凋亡细 PHB539(1．81：1：0．416)， Caspase．9 V．FITC和Hoechst染色均在荧光显微镜下观测有 PHB539(2．81士0．517)。Annexin 明显的凋亡现象，且凋亡比例和强度比阴性对照强。 结论：靶向PHB．siRNA干扰可以有效的沉默大肠癌细胞PHB基因，下调 PHB蛋白水平，从而抑制大肠癌细胞增殖、促进大肠癌细胞凋亡；实验筛选出 实验提供理论、技术基础；靶向干扰PHB基因为大肠癌基因治疗研究提供理论 依据。 SiRNARNA干扰 关键词：Prohibitin 4 EffectofRNA—mediatedinhibitionof prohibitiongene onthe featuresofcoloncarcinomacells expressionbiological Abstraet the roleofProhibitin(PHB)in objectives：Toinvestigateregulatory proliferation， ofcolorectal linesbasedonRNAinterference apoptosis，andcycle carcinoma(CRC)cell theoreticaland basisforthetreatment (RNAi)technology,andprovide experimental ofCRCRNAi． by Methods：Westernblotwasusedto the ofPHBinhumanCRC assayexpressio