SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测人c-myc基因方法的建立.pdfVIP

2009仨 12月 首 都 医 科 大 学 学 报 Dec．2009 第30卷 第6期 JournalofCapitalMedicalUniversity Vo1．30 No．6 [doi：10．3969／j．issn．1006-7795．2009．06．022] · 基 础 研 究 · SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测人 —myc 基因方法的建立 孙秀静 朱圣韬 徐有青 张澍田 (1．首都医科大学附属北京天坛医院消化内科；2．首都医科大学附属北京友谊医院消化内科) 【摘要】 目的 构建含有c—myc基因的重组质粒并以其为模板，建立以SYBRGreenI染料为荧光指示剂 的实时荧光定量 PCR (FQ-PCR)技术检测c—myc的标准曲线，为FQ—PCR准确检测c—myc奠定基础。方法 用反转录聚合酶链反应 (RT—PCR)法从人 食管鳞癌组织的总 mRNA中反转录扩增c—myccDNA，将纯化的PCR产物与pGEM—TEasy载体进行连接 ，转化宿主菌 DH-5o~，然 后挑选阳性克隆重组质粒，分别用PCR扩增、限制性核酸内切酶EcoRI酶切进行鉴定并测序分析。用紫外分光光度计测质粒浓 度，计算拷贝数制备FQ—PCR浓度梯度标准品。最后对质粒标准品进行FQ—PCR检测。结果 PCR扩增、酶切鉴定及测序分析均 证实c—myc重组到pGEM—TEasy载体上。建立了人c—myc标准曲线 ，其对数与相应的ct值 (循环阈值)具有 良好 的相关性 ，相关 系数r=一0．99～一1，斜率为一3．1～一3．6。结论 所构建的人c—myc质粒标准品应用SYBRGreenI荧光染料技术建立的标 准曲线线性关系好 ，灵敏性和特异性高，准确可靠 ，此方法可作为FQ—PCR检测 c—myc基因的标准方法。 【关键词】 SYBRGreenI染料；实时荧光定量；反转录聚合酶链反应；c—myc基因 【中图分类号】 Q78 A Sensitive and Specific Method of Real-time Fluorescence Quantitative PolymeraseChainReactionUsingSYBR Green I forDetectionofc-mycGene SUNXiu-jing，ZHUSheng—tao，XUYou．qing，ZHANGShu—tian (1．DepartmentofGastroenterology，BeijingTiantanHospital，CapitalMedicalUniversity；2．DepartmentofGastroenterology， BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity) 【ABSTRACT】 Objective Toconstructtherecombinantplasmidandstandardcurvefordetectionofc—mycgenebyreal-timequantitative PCR(FQ—PCR)usingSYBRGreenIandestablishtheFQ—PCRassayofraccuratedetectionofc—mycgene．Methods Thec—myccDNAwas acquiredbyreversetranscriptasepolymerasechainreaction(RT—PCR)afterisolatingtotalRNAfromtissueofhumanesophagealsquamous cellcarcinoma(ESCC)．ThepurifiedproductofPCRwassubseuqentlyligatedwithpGEM—TEasyvectornadtrnasferredintobacteriumDH一 5a．Therecombinantplasmidpickedoutrfom positivecloneswasamplifiedbyPCR，digestedwithrestrictionendonuclearEcoRInad sequenced．Th emassconcentrationoftherecomb inantplasmidwasmeasuredandtr