重叠延伸PCR克隆拟南芥ACCase基因和植物表达载体构建.pdfVIP

2009年 l2月 中国油料作物学报 2009，31(4)：407—412 Chinesejournalofoilcropsciences 重叠延伸PCR克隆拟南芥ACCase 基因和植物表达载体构建 胡亚平，夏玉平 ，吴 刚，武玉花，肖 玲，李 均，卢长明 (中国农业科学院油料作物研究所，农业部油料作物生物学重点开放实验室，湖北 武汉430062) 摘要：植物的乙酰辅酶 A羧化酶(ACC~e)催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A，是脂肪酸合成的第一 步，该步骤是种子脂肪酸合成与含油量形成的关键调控步骤。拟南芥中的真核形式ACC~e基因eDNA长约7000 bp，难以直接克隆。本研究先通过常规PCR将其 cDNA分成八个重叠的片段分别扩增出来，再用重叠延伸PCR将 得到的片段逐步拼接成长度为6890bp的完整的基因序列，测序证实克隆序列正确无误，最后将其克隆到农杆菌转 化植物的载体上。序列分析发现ACCase基因的开放阅读框长度为6765bp，编码一个含2254个氨基酸残基的多 肽链，推测其分子量约为250kDa。ACC~e基因的成功克隆为利用该基因调控油料作物的含油量奠定了良好基础， 同时为克隆长度较大的基因提供了一种经济可行的方法。 关键词：重叠延伸PCR；乙酰辅酶A羧化酶；基因克隆 中图分类号：A565．4；Q78 文献标识码：A 文章编号：1007—9084(2009)04—04o7一O6 An overlapextension PCR methodusedinisolationoflongeDNAs ofacetyl-CoA carboxylasefrom Arabidopsis HUYa—ping，XIA Yu-ping，WUGang，WU Yu—hua，XIAOLing，LIJun，LUChang—ming (OilCropsResearchInstitute，CAAS，KeyLaboratoryofOilCropBiology oftheMin~tryofAgriculture，Wuhan430062，China) Abstract：Acety1．CoAcarboxylase(ACCase)isabiotin—dependentenzymethatcatalyzestheirreversiblecar— boxylationofacetyl·CoA toproducemalonyl—CoA，whichisthekeyregulationstepforfattyacidsynthesisandoilae— cumulation．TheeDNA sequenceforArabidopsisACCasegenewasabout7000bpinlengthandisverydifficultto clonebyconventionalmethod．Inthisstudy，wefirstamplified8overlapfragmentscovetinghtewholeACCasese- quenceandhtensplicedhtem intoan integratedsequencebyhteoverlapextensionPCR technique．ThewholeAC— CasesequencewasclonedintotheTiplasmidusedofrplanttransformationaftersequencing．Sequenceanalysisin— dicatedthattheobtainedsequenceconsistedofa6765bpopenreadingframeencodinga2254 aminoacidpoly— pepfidewiht amolecularweightabout250kDa．ThesuccessfulcloningofACCasegenemakesitpossibletoutilize htegenetoimproveseedoilcontentinoilseedcrops．Itals