荷叶离褶伞多糖的提取工艺及其抑菌作用的研究.pdfVIP

Ill一 iIl— ACADEMIC FORUM 湿茵丝体一烘干一粉碎一热水浸提一过滤除渣一醇沉24h一 1．2．3多糖含量的测定 离心去上清液一沉淀物溶解定容至5Oml—seVage法除蛋白一再次 采用苯酚一硫酸法 。取样品lml，加入 lml蒸馏水再加入 定容至 5Oral一测吸光度 。 lml质量分数为5％的苯酚溶液和5ml浓硫酸摇匀后于2512静 1．2．1．2荷叶离褶伞菌丝体多糖提取方法 置20min，于波长490nm处处测其吸光值 ，根据标准曲线即得 多糖含量。 表 1菌丝体多糖提取工艺正交设计因素水平 1．2．4荷叶离褶伞多糖提取物抑菌性检测 1．2．4．1抑菌实验 将多糖提取物配制成浓度为356g／ml的溶液，采用圆纸片 法测定其抑菌活性。分别刮取活化后的供试菌(7种)菌苔于 50ml生理盐水中，震荡摇匀得菌悬液，分别用移液枪吸取0．2ml 置于培养基平板上，涂匀。取已消过毒的圆形滤纸(6ram)用 糖液浸泡过夜。捞出略干后贴于培养基平板上，同时作一溶剂 空白对照。恒温培养 (细菌36~C～37℃，18～24h}真菌28℃～ 将湿菌丝体烘干，粉碎后称取荷叶离褶伞菌丝体粉末O．5g， 加95％乙醇浸泡2h后，过滤，取滤渣，于 80~C烘箱内烘干。以 30℃，48～72h)后分别观察结果 ，测量抑菌圈直径大小。以 提取温度、水料 比和提取时间为试验因素，在单因素试验的基础 上步骤均按无菌条件操作，每个样品设两个平行样，结果取平 上按表1做正交试验，进行多糖提取。每组提取次数均为两次，然 均值。 后合并滤液，浓缩滤液至原体积的15／，浓缩液加入4倍体积的 1．2．4．2最小抑菌浓度的测定 采用圆纸片法 ，方法同上，将多糖溶液稀释成17．5、8．75、 95％乙醇，充分搅拌后置冰箱过夜沉淀。弃上清，3000rm／in离心 lOmin，收集沉淀。沉淀用适量蒸馏水溶解并定容至 lOOml，置于 4．375、2．1875、1．0937g／ml的浓度梯度，以未见抑菌圈的最 分液漏斗，按照 1：1量加入Sevage试剂(氯仿 ：正丁醇--4：1)， 高浓度为MICl】。1。 振荡30min，静置 ，分离数次。直到没有乳白色变性蛋白质析出 2结果与分析 2．1菌丝体多糖提取条件的确定 为止，收集上清液，定容至50ml待用。 1．2．2荷叶离褶伞发酵液多醣提取 荷叶离褶伞菌丝体多糖热水浸提法浸提次数均为两次，影 1．2．2．1荷叶离褶伞发酵液多糖提取工艺流程 响热水浸提法的因素主要有浸提温度、浸提时间和水料比。试 荷叶离褶伞茵丝体发酵液10mI一过滤除渣一醇沉一离心去 验在单因素试验的基础上采用3因素3水平正交法确定最佳浸 上清液一沉淀物溶解定容至 50ml— sevage法除蛋 白一再次定容 提条件。 至50ml一测吸光度 。 从表3极差分析结果可以看出，影响热水浸提法的因素主