环介导等温扩增技术检测水稻白叶枯菌方法建立.pdf

摘要 摘要 isothermal 环介导等温扩增(100p．mediated 利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、 高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在1h内能扩增出109靶序列拷贝，扩 增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA 片段的混合物，电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。 LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的 科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。 本研究针对水稻白叶枯菌(XanthomoBa$oryzae 收录号为AFl69030的一段序列设计了一套特异性的引物，利用环介导等温扩增 技术(LAMP)来扩增Xoo基因组DNA，扩增出一系列反向重复的靶序列构成的 茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物，成功建立了LAMP检测Xoo 的新方法。该检测方法特异性好、敏感性高而且节省时间。 研究中分别设计了LAMP的不同引物浓度比、M92+浓度梯度、温度梯度、时 间梯度等实验来优化反应条件，从而获知在内外引物浓度比为1：4、M92+添加 DNA 的浓度梯度实验和PCR的浓度梯度实验进行对比，发现LAMP对抽提的Xoo DNA最低检出浓度为4．6ng／tube，即 最低检出浓度为46pg／tube，PCR对Xoo LAMP技术的灵敏度是PCR的100倍。此外，LAMP能检测到直接裂解菌液中的 DNA，而PCR却检测不到。 关键词：环介导等温扩增；核酸；链置换反应；内引物；外引物；水稻白叶枯菌 ABSTRACT ABSTRACT Anovelnucleicacid isothermal method，termedloop-mediated amplification DNAwith amplification(LAMP)，whichamplifies high of under beavaluabletoolforthe detection isothermal rapidity conditions，may rapid infectiousdiseases．Thismethod aDNA thathave of employspolymeraseactivity a four that strand DNA andsetof speciallydesignedprimers displacementsynthesis atotalofsixdistinct onthe DNA．LAMPcan a target amplify recognize sequences few ofDNA109inlessthananhour．Thefinal ar